Анализ крови на малярию бланк

Возбудителем малярии является малярийный плазмодий. Он относится к классу простейших. Причинными агентами могут являться 4 вида плазмодиев (хотя их в природе насчитывается более 60 видов):

• Р. Malariae – приводит к малярии с 4-дневным циклом;
• Р.vivax – вызывает малярию с 3-дневным циклом;
• Р. Falciparum – обуславливает тропическую малярию;
• Р. Ovale – вызывает овале-форму трехдневной малярии.

В эндемичных странах часто наблюдается микст-инфекция. Она характеризуется одновременным заражением несколькими видами плазмодиев. При паразитологическом исследовании они выявляются в крови.

Жизненный цикл малярийных плазмодиев включает в себя последовательную смену нескольких стадий. При этом происходит смена хозяев. На стадии шизогонии возбудители находятся в организме человека. Это стадия бесполого развития, её сменяет стадия спорогонии.

Она характеризуется половым развитием и протекает в организме самки комара, который и является разносчиком инфекции. Причинные комары относятся к роду Анофелес.

Возбудитель тропической
малярии Plasmodium falciparum — одноклеточный микроорганизм.
Жизненный цикл состоит из полового размножения (спорогония) в
организме переносчика — самки комара рода Anopheles и бесполого
размножения в организме человека — шизогонии.

Шизогония включает
две фазы — первую внеэритроцитарную, в клетках печени и последующие
повторные циклы размножения в эритроцитах. В последних образуются
бесполые формы, которые в течение 48 часов проходят ряд возрастных
стадий, заканчивающихся образованием нового поколения паразитов.

Наряду с бесполыми формами образуются половые, которые заражают
комара, в котором происходит дальнейшее развитие половых форм
паразита. При тропической малярии в
периферической крови образуются эритроциты с молодыми —
кольцевидными бесполыми стадиями паразита.

Развитие последующих
возрастных стадий происходит в сосудах внутренних органов.
Появление в крови зрелых стадий паразита свидетельствует о
нарушении микроциркуляции крови, что наблюдается при
злокачественном течении инфекции.

Созревание половых форм P.
falciparum происходит в сосудах внутренних органов в течение 8-12
дней, после чего зрелые половые формы появляются в периферической
крови.

Гаметоциты обнаруживаются в крови в течение месяца. Возбудитель тропической
малярии способен вырабатывать устойчивость к противомалярийным
препаратам.

Этому способствует длительное применение
химиопрепаратов в очаге, если одновременно не назначают
противомалярийные препараты с разным механизмом действия.
Существуют штаммы возбудителя с резистентностью к препаратам
разного механизма действия (множественная устойчивость).

В одной и
той же местности наряду с чувствительными к химиопрепарату штаммами
паразита могут существовать и резистентные с разной степенью
устойчивости. Штаммы P.

falciparum,
устойчивые к пириметамину (син. хлоридин, тиндурин) и прогуанилу
(син.

бигумаль), зарегистрированы почти во всех зонах
распространения этой инфекции. Устойчивость к хлорохину наиболее
широко распространена в странах Юго-восточной Азии, регистрируется
в ряде стран Южной и Центральной Америки, нарастает ее
распространенность в странах Африки.

В клинической картине малярии выделяют несколько стадий.

Стадиями малярии являются:

• стадия инкубации;
• стадия первичных проявлений;
• стадия ранних и поздних рецидивов;
• стадия выздоровления.

Инкубационным периодом называется отрезок времени с момента попадания малярийного плазмодия в организм до появления первых симптомов. Длительность этого периода зависит от вида малярийного плазмодия.

Длительность инкубационного периода в зависимости от вида малярии

Длительность инкубационного периода может изменяться, если ранее была предпринята неадекватная профилактика.

Стадия первичных проявлений

Для этой стадии характерно появление классических лихорадочных приступов. Начинаются эти приступы с потрясающего озноба, пронизывающего все тело. После него следует фаза жара (

максимальное поднятие температуры

Проявления малярии
обусловлены развитием паразита в эритроците — так называемой
эритроцитарной шизогонией. В процессе эритроцитарной шизогонии
образуются бесполые и половые формы паразита.

Бесполые формы за период
времени, характерный для каждого вида паразита, проходят в
эритроцитах ряд последовательных возрастных стадий своего развития,
строение которых (морфология) и их окрашиваемость (тинкториальные
свойства) хорошо различимы в «тонком мазке» крови.

Трофозоиты — одноядерные растущие стадии:
кольцевидные, развивающиеся (амебовидные, полувзрослые) и зрелые.
Шизонты — делящиеся стадии: развивающиеся (незрелые),
с последовательным делением ядер и общей цитоплазмой и зрелые,
представляющие скопление дочерних клеток мерозоитов с
обособленными ядрами и цитоплазмой.

В динамике эритроцитарная
шизогония в общем виде протекает следующим образом. Мерозоит,
внедрившийся в эритроцит, быстро увеличивается в размере, в
цитоплазме появляется пищеварительная вакуоль и образуется —
кольцевидный трофозоит.

На этой стадии цитоплазма
имеет вид узкого ободка, огибающего пищеварительную вакуоль, ядро
сравнительно мелкое, компактное с трудно различимой структурой
хроматина, оттеснено к одному из полюсов клетки.

По мере роста
паразита увеличиваются его размеры, количество цитоплазмы
нарастает: ядро становится более крупным, менее компактным. В
цитоплазме могут появиться асимметричные утолщения, различающиеся
по форме и числу, псевдоподии — образуется амебовидный
трофозоит.

В дальнейшем у развивающегося трофозоита
постепенно исчезает вакуоль, продолжает увеличиваться ядро и
количество цитоплазмы — образуется зрелый трофозоит.
Зрелый трофозоит — округлая или несколько вытянутая клетка с
относительно рыхлым ядром, правильной или несколько вытянутой
формы, занимающая весь или часть пораженного эритроцита.

Затем
наступает стадия шизонта, начинается попарное деление
ядер, образуется развивающийся (незрелый) шизонт. По
окончании деления ядер одномоментно делится цитоплазма, обособляясь
вокруг каждого из дочерних ядер — образуется зрелый
шизонт, состоящий из мерозоитов; их число, размеры и
расположение по отношению к скоплению пигмента характерны для
каждого вида плазмодиев (см.

таблицы). При отсутствии или
неэффективном лечении мерозоиты внедряются в интактные эритроциты,
и цикл вновь повторяется с присущей для каждого вида плазмодиев
продолжительностью развития одной генерации.

malariae — 72
ч. В
процессе роста паразита в его цитоплазме появляется
малярийный пигмент — продукт метаболизма гемоглобина,
представляющий собой включения от едва заметных мелких зерен и
гранул до относительно более крупных, неправильной формы, от
золотисто-коричневого до черного цвета.

Количество пигмента,
размеры его частиц и распределение в цитоплазме паразита меняются
по мере его перехода в последовательные стадии развития. У
части трофозоитов деления ядер не происходит и они дифференцируются
в половые формы, гаметоциты — женские
(макрогаметоциты) и мужские (микрогаметоциты).

Мужские и женские
гаметоциты различаются между собой по морфологии, в первую очередь
по структуре ядра, характеру и окраске цитоплазмы. В отличие от
бесполых форм гаметоциты не имеют выраженной вакуоли,
характеризуются значительно более обильным и грубым пигментом.

Округлая форма присуща гаметоцитам Р. vivax, Р.

ovale
и Р. malariae, удлиненная серповидная (полулуния) —
Р.

falciparum. Гаметоцитов образуется меньше, чем
бесполых форм.

При этом женских гаметоцитов в 3-5 раз больше, чем
мужских, что затрудняет выявление последних. Гаметоциты Р.

malariae значительно отличаются от
гаметоцитов Р. falciparum по срокам созревания,
появления в периферической крови и сохранения способности заражать
переносчика (самок комара Р.

ovale и Р.
malariae развиваются в эритроцитах, циркулирующих в периферической
крови.

Развитие Р. falciparum происходит в синусах селезенки и
мелких капиллярах внутренних органов в связи с адгезией пораженных
эритроцитов к стенкам таких капилляров.

В периферической крови
обнаруживаются, преимущественно при неосложненном течении, только
самые молодые стадии — кольцевидные трофозоиты. Их число очень
быстро нарастает, поэтому при однократном исследовании
периферической крови в начале болезни можно получить неправильное
представление об истинном числе паразитов.

При осложненном течении
в периферической крови могут быть обнаружены более зрелые
возрастные стадии паразита и гаметоциты в связи с нарушением
сосудистого тонуса. При оценке результатов
исследования препаратов крови, наряду с типичной морфологией
возбудителя, необходимо учитывать ряд особенностей, характеризующих
паразитологическое развитие инфекции собственно и привходящих
воздействий (предшествовавшее применение противомалярийных
препаратов, неправильное приготовление и окраска препаратов
крови).

У детей признаки малярии отличаются большим разнообразием, которое определяется возрастом ребенка и его иммунной системой.

К признакам малярии у детей относятся:

• лихорадка;
• анемия;
• сыпь;
• расстройства со стороны желудочно-кишечного тракта;
• расстройства со стороны нервной системы;
• судороги;
• увеличение селезенки и печени.

Является основным симптомом детской малярии. Она может быть как постоянной, так и в виде приступов. Классические приступы, которые характерны для взрослых, встречаются редко. Такие приступы проходят в несколько этапов. Первый этап – озноб; второй – жар (

); третий – проливной пот. Для детей характерны высокие подъемы температуры до 40 градусов и более.

Чем младше ребенок, тем сильнее у него лихорадка. Во время второго этапа – дети возбуждены, у них регистрируется учащенное дыхание, сухая и красная кожа.

Падение температуры сопровождается проливным потом и сильной, истощающей слабостью. Такие классические приступы редки для детей.

Чаще температура имеет непостоянный характер, а у 10 – 15 процентов детей малярия и вовсе протекает без лихорадки. У грудных детей чаще наблюдается постоянная температура, сонливость, вялость.

Эквивалентом приступа у грудных детей является резкое побледнение кожи, переходящее в цианоз (

синюшную окраску кожи

). При этом кожа становится резко холодной, наблюдается тремор конечностей.

Как правило, малярия у детей протекает с тяжелой анемией. Она появляется уже с первых дней заболевания и нередко является ранним диагностическим признаком. Развивается она вследствие массивного разрушения эритроцитов. Число эритроцитов иногда снижается до 30 – 40 процентов от нормы.

Отличительным признаком малярийной инвазии у детей являются изменения в крови не только со стороны эритроцитов и гемоглобина, но и других элементов крови. Так, очень часто отмечается общее снижение лейкоцитов (

), тромбоцитов. В то же время скорость оседания эритроцитов увеличивается. Несмотря на тяжелую анемию, желтуха у детей, больных малярией, отмечается лишь в 15 – 20 процентах случаев.

Сыпь особенно часто наблюдается у маленьких детей. Сначала она появляется на животе, затем распространяется на грудную клетку и другие части тела. Характер сыпи может быть самым разнообразным — петехиальным, пятнистым, геморрагическим. Развитие сыпи обусловлено снижение числа тромбоцитов и повышенной проницаемостью сосудистой стенки.

Расстройства со стороны желудочно-кишечного тракта

Расстройства со стороны системы пищеварения отмечается почти всегда. Чем младше ребенок, тем разнообразнее эти расстройства. Проявляются они в виде диареи, неоднократной рвоты, тошноты. Часто отмечается жидкий стул с примесью слизи, который сопровождается

Главным признаком малярии у взрослых являются приступы лихорадки (

) сменяющиеся состоянием покоя. Они характерны для всех форм заболевания, кроме тропической малярии. Перед первым приступом пациента может беспокоить головная боль, болезненные ощущения в мышцах и суставах, общее недомогание. Также может повышаться температура тела до субфебрильных значений (

). Такое состояние продолжается в течение 2 – 3 дней, после чего начинаются лихорадочные пароксизмы.

Для малярийных приступов характерно наличие фаз, которые развиваются и сменяют друг друга в определенной последовательности. Сначала приступы могут носить неправильный характер, но через несколько дней устанавливается четкая схема развития этого признака.

Продолжительность пауз между приступами зависит от формы болезни. При трехдневной малярии приступ повторяется один раз в 3 дня, при четырехдневной малярии – раз в 4 дня.

Развиваются приступы в одно и то же время, чаще всего между 11 и 15 часами.

Эта стадия может проявляться как несильным дрожанием, так и сильным ознобом, от которого у пациента сотрясается все тело. При этом руки, ноги и лицо больного становятся холодными и приобретают синюшный оттенок. Пульс учащается, а дыхание становится поверхностным. Кожные покровы бледнеют, становятся шероховатыми и обретают синеватый цвет. Озноб может длиться от получаса до 2 – 3 часов.

Данная фаза сопровождается резким увеличением температуры, которая может достигать выше 40 градусов. Состояние больного заметно ухудшается.

Лицо становится красным, кожа – сухой и горячей на ощупь. Пациент начинает испытывать сильные головные боли, тяжесть в мышцах, учащенное болезненное сердцебиение.

Язык обложен сероватым налетом и при этом недостаточно влажен. Нередко стадия жара сопровождается рвотой и .

. Больной пребывает в состоянии возбуждения, могут отмечаться судороги и потеря сознания. Жар провоцирует неутолимую жажду. Продолжаться такое состояние может от 5 – 6 до 12 часов.

Стадию жара сменяет финальная фаза, которая манифестируется обильным потоотделением. Температура резко снижается до нормальных значений, иногда может достигать 35 градусов. Больной при этом чувствует облегчение, успокаивается и засыпает.

Вместе с приступами в число наиболее характерных признаков малярии входят анемия (

малокровие

). Также данное заболевание обладает рядом симптомов, которые проявляются как на физическом, так и психическом уровне.

К признакам малярии относятся:

• анемия;
• спленомегалия;
• гепатомегалия;
• расстройства мочеиспускания;
• дисфункция сердечно-сосудистой системы;
• желтушное окрашивание кожных и слизистых покровов;
• кожные кровоизлияния;
• герпетические высыпания (проявления герпеса);
• нервные расстройства.

У больных малярией резко развивается анемия, которая характеризуется дефицитом гемоглобина и эритроцитов. Развивается она из-за массивного разрушения эритроцитов, по причине обитания в них малярийного плазмодия (

так называемая гемолитическая анемия

). Наиболее очевидны признаки анемии в период между приступами. Однако сохраняться анемия может еще длительное время после выздоровления. Кожа пациента становится желтоватого или землистого цвета, отмечается слабость, повышенная утомляемость. При анемии ткани организма испытывают сильную кислородную недостаточность, потому как гемоглобин является переносчиком кислорода.

Спленомегалия

Увеличение селезенки отмечается спустя 3 – 4 приступа лихорадки и сохраняется на протяжении длительного времени. При тропической малярии селезенка может увеличиться сразу после первого пароксизма.

Вместе с увеличением наблюдается болезненность этого органа. Селезенка становится более плотной, что определяется при пальпации.

При отсутствии адекватного лечения, селезенка увеличивается настолько, что начинает занимать всю левую часть живота.

Гепатомегалия

Увеличение печени происходит быстрее, чем изменение селезенки. При этом край печени опускается ниже реберной дуги, становится более плотным и болезненным. Больной жалуется на болезненный дискомфорт в зоне правого подреберья.

На фоне происходящих процессов в организме, при приступах во время озноба у пациентов наблюдается учащенное мочеиспускание. При этом моча обладает почти прозрачным цветом. При наступлении жара объем мочи становится более скудным, а цвет приобретает темный оттенок.

Дисфункция сердечно-сосудистой системы

Наиболее резко нарушения сердечно-сосудистой системы выражены при малярийных пароксизмах. Характерными для этого заболевания признаками является увеличение артериального давления во время озноба и его падение во время жара.

Желтушное окрашивание кожных и слизистых покровов

Является ранним признаком малярии у взрослых. Когда эритроциты разрушаются из них выходит не только гемоглобин, но и билирубин (

). Он и придает желтый цвет кожным покровам и слизистым. У людей с темным цветом кожи выявить желтушное окрашивание порой сложно. У них желтуха определяется по цвету видимых слизистых, а именно склер (

). Желтоватый цвет склер или же их иктеричность может появляться задолго до желтушного окрашивания кожи, поэтому является важным диагностическим признаком.

Вследствие спазмов сосудов на теле пациента образуется геморрагическая сыпь (

). Сыпь не имеет конкретной локализации и неравномерно распространяется по всему телу. Внешне данный признак выглядит как звездчатые пятна синего, красного или фиолетового цвета.

Если пациент с малярией является носителем вируса герпеса, во время лихорадочного состояния он обостряется. Характерные для вируса пузырьки с прозрачной жидкостью появляются на губах, крыльях носа, реже на других зонах лица.

Наиболее явно нарушения нервной системы проявляются при трехдневной и тропической малярии. Пациенты испытывают постоянные головные боли,

, вялость по утрам и в течение дня. Негативным изменениям подвергается психика больных во время приступов. Они находятся в подавленном состоянии, плохо ориентируются, спутано отвечают на задаваемые вопросы. Нередко в период жара пациенты бредят, испытывают

. Для тропической малярии характерно буйное состояние больного, которое может продолжаться даже после приступа.

заключается в повышенном риске развития злокачественных форм заболевания. Физиологические изменения, сопровождающие процесс вынашивания ребенка, делают женщину более восприимчивой к инфекции.

Характер последствий определяет срок беременности, на котором произошло заражение малярией. Также на исход болезни оказывает влияние состояния организма женщины и сроки, на которых было начато лечение.

Негативное воздействие возбудители инфекции могут оказывать как на беременную женщину, так и непосредственно на сам плод.

Последствие малярии для женщины

Наибольшую опасность инфекция представляет при заражении ею на ранних сроках вынашивания ребенка. Наиболее частым последствием является самопроизвольный аборт.

Прерывание беременности происходит по причине необратимых изменений, произошедших в организме женщины под воздействием малярийных плазмодиев. При сохранении беременности дети часто рождаются недоношенными, среди которых 15 процентов погибают при родах и 42 процента умирают в первые дни после появления на свет.

Среди доношенных детей, рожденных от женщин, инфицированных малярией, процент мертворожденных на порядок выше, чем у остальных рожениц. Часто дети пациенток с малярией рождаются с недостаточным весом и на протяжении первых лет жизни часто болеют.

Осложнениями малярии при беременности являются:

• анемия (в народе малокровие);
• нефропатия (форма позднего токсикоза, вызванная дисфункцией почек);
• эклампсия (критические осложнения по причине поражения головного мозга);
• гипогликемия (снижение сахара в крови).

Недостаток гемоглобина в крови провоцирует множественные патологические процессы в организме женщины. Печень перестает вырабатывать необходимое количество

для формирования новых клеток, в результате чего может наступить внутриутробная задержка развития эмбриона. Токсины перестают выводиться в полном объеме, что может привести к недостаточному снабжению плода кислородом.

Другими последствиями малярии по причине анемии являются:

• выкидыш или преждевременные роды ;
• отслойка плаценты раньше времени;
• рождение мертвого ребенка;
• слабость родовой деятельности.

Нефропатия развивается после 20 недели беременности и проявляется повышением артериального давления, отечностью рук и лица, бессонницей и головными болями. Лабораторные анализы при данном расстройстве определяют в моче повышенное содержание белка и

. Последствиями нефропатии могут быть задержка внутриутробного развития, замирание беременности, гибель плода.

Данное расстройство развивается на фоне повреждения мозговых клеток, которые провоцирует малярийная инфекция. Проявляется эклампсия судорожными припадками, после которых пациентка впадает в кому.

Через некоторое время больная возвращается в сознание. В некоторых случаях возможно развитие продолжительной комы, из которой женщина не может выйти.

Спазмы сосудов, которые происходят при судорогах, могут привести к асфиксии (

удушью

) эмбриона. Нередко эклампсия становится причиной внутриутробной гибели плода. У беременной женщины данное осложнение малярии может спровоцировать

, сердечную или легочную недостаточность, дисфункцию печени или почек. Нередко на фоне этого расстройства происходит преждевременная отслойка плаценты. Все эти патологии могут привести к гибели как плода, так и самой женщины.

Данный синдром может развиться у беременных женщин, зараженных тропической малярией. Гипогликемия проявляется приступами, неоднократное повторение которых может нанести вред как плоду, так и будущей матери.

Отсутствие требуемого количества глюкозы может спровоцировать у эмбриона нарушения сердцебиения или отставания в физическом и умственном развитии. Для женщин данное состояние чревато угнетением когнитивных функций, подавленным состоянием, расстройством внимания.

Последствия малярии для плода

Плацента не является барьером для малярийных плазмодиев. Вызывая патологические изменения в структуре плаценты, паразиты могут инфицировать плод. Внутриутробная малярия встречается в 7 процентах случаях. Наиболее вероятно заражение плода при тропической малярии. Если инфицирование произошло на начальных сроках вынашивания ребенка (

), гибель плода является наиболее распространенным исходом. При заражении на более поздних сроках ребенок может родиться недоношенным. Часто последствием заражения малярией является недостаточный вес младенцев и другие физические патологии.

Также к последствиям врожденной малярии относятся:

• желтуха;
• эпилептические припадки;
• анемия (часто в тяжелой форме);
• отек легких ;
• увеличенная печень и/или селезенка;
• повышенная восприимчивость к инфекциям.

Последствия внутриутробного заражения могут быть выявлены сразу или спустя некоторое время после рождения.

• Лихорадка, ознобы – периодические обострения лихорадки
• Болезненность в суставах
• Рвота — периодические приступы
• Анемия, вызванная массивным разрушением эритроцитов
• Гемоглобинурия — выведение гемоглобина с моче
• Увеличенная селезенка – вызвана ускоренным разрушением эритроцитов.
• Периодические головные боли – вызваны нарушением кровообращения
• Анемия – связана с ускоренным разрушением эритроцитов
• Желтуха – связана с ускоренным разрушением эритроцитов и разрушением гемоглобина.

Обычно течение малярии тяжелое. Возможно течение благоприятное, малосимптомное, атипичное, осложненное и летальный исход.

Характерные симптомы малярии описываются известной триадой:

• пароксизмальное (по типу кризов) повышение температуры, повторяющееся через определенные промежутки времени (3 или 4 суток);
• увеличение печени и селезенки (гепатомегалия и спленомегалия соответственно);
• анемия.

Первые симптомы малярии неспецифичны. Они соответствуют продромальному периоду и проявляются признаками, характерными для любого инфекционного процесса:

• общее недомогание;
• выраженная слабость;
• боли в пояснице;
• суставные и мышечные боли;
• незначительное повышение температуры;
• сниженный аппетит;
• головокружение;
• головная боль.

Специфическое повышение температуры развивается вследствие выхода плазмодиев в кровь. Этот процесс неоднократно повторяется, находя отражение в температурной кривой. Время цикличности различно – в одних случаях оно составляет 3 суток, а в других – 4.

На основании этого и выделяются соответствующие разновидности малярии (трехдневная и четырехдневная). Это период явных клинических проявлений, когда больной обращается к врачу.

Лихорадка при малярии имеет характерный вид, обусловленный последовательной сменой трех фаз. В начале стадия озноба (человек не может согреться, несмотря на теплые укутывания), на смену которой приходит жар (вторая стадия). Температура повышается до высоких значений (40-41°С).

Заканчивается приступ повышенной потливостью. Обычно он длится от 6 до 10 часов. После приступа человек сразу же засыпает из-за выраженного ослабления, развившегося в результате интоксикации и мышечных сокращений.

Увеличение печени и селезенки определяется не с самого начала заболевания. Данные симптомы можно выявить уже после 2-3 лихорадочных приступов. Их появление обусловлено активным размножением малярийных плазмодиев в печени и селезенке.

При инфицировании в крови сразу же появляется анемия, связанная с разрушением эритроцитов (в них поселяются малярийные плазмодии).

Одновременно снижается уровень лейкоцитов, преимущественно нейтрофилов. Другими гематологическими признаками является ускорения СОЭ, полное отсутствие эозинофилов и относительное повышение лимфоцитов.

• Гемоглобин – показатель снижен
• Эритроциты – показатель снижен
• Цветовой показатель – норма, ниже нормы
• Средний объем эритроцита (MCV) – ниже нормы
• Лейкоциты – повышены
• Тромбоциты – повышены

• Гемоглобинурия – гемоглобин в моче
• Гематурия — сгустки крови в моче
• Эритроцитурия – не видимые глазом эритроциты в крови

• Активность АЛТ и АСТ — повышена
• Билирубин прямой и непрямой — повышен
• Уровень альбумина — повышен

• Клинические – характерные клинические проявления (симптомы), наличие лихорадки.
• Эпидемические – пребывание больного в регионах эндемичных по малярии в период последних трех лет.
• Анамнестические (история жизни больного): перенесенная ранее малярия, факты переливания крови.
• Лабораторные исследования остаются основными критериями в постановке диагноза «малярия».

Паразитологическая
диагностика малярии основана на обнаружении бесполых и половых форм
возбудителя при микроскопическом исследовании крови, что возможно
только в период его развития в эритроците. Для обнаружения
плазмодиев и определения их вида используют препараты крови,
приготовленные методом «тонкого мазка» и «толстой капли»,
окрашенные по Романовскому-Гимза.

Оба метода, имеющие свои
преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими. Основной метод —
«толстая капля».

Благодаря распределению относительно
большего объема крови на меньшей площади, за один и тот же
промежуток времени просматривается количество крови в 30-40 раз
большее, чем в «тонком мазке», что значительно повышает шанс
обнаружения паразитов, особенно при низкой паразитемии.

Начинать
надо всегда с просмотра «толстой капли». Чувствительность метода
«толстой капли» такова, что при просмотре 100-150 полей зрения
можно обнаружить около 8 паразитов в 1 мкл крови.

Концентрация
исследуемой крови на ограниченной площади приводит к многослойному
расположению эритроцитов. Для того чтобы паразиты были видимы,
«толстую каплю» окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу
эритроцитов, и паразиты подвергаются деформации.

Несмотря на
определенную специфичность, такая деформация иногда может
препятствовать идентификации вида паразита. Ограничиться просмотром
«толстой капли» можно только, если вид паразита был первоначально
установлен.

В
«тонком мазке», фиксированном до окраски, сохраняются
морфологические особенности как пораженного эритроцита, так и
присущие данному виду паразита. Большое значение для
дифференциального диагноза имеет характер изменения пораженных
эритроцитов.

«Тонкий мазок» крови делают в дополнение к «толстой
капле». В тех случаях, когда вид возбудителя в очаге установлен,
для эпиднадзора за очагом можно ограничиться методом «толстой
капли».

1. Предметные стекла
новые замачивают в мыльном растворе, нагревают до 60-80 °С, но не
кипятят.

2. Каждое предметное
стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной
воде в течение 2-3 ч, периодически перемешивая.

4. Погружают в
дистиллированную воду на 30 мин.

5. Проверяется качество
отмывки предметных стекол от щелочи: на предметное стекло наносят 1
каплю фенолфталеина — появление розовой окраски раствора
свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

1) Любое повышение температуры тела у человека, находящегося в эндемичном географическом районе (страны с повышенной заболеваемостью).

2) Повышение температуры у человека, которому в течение последних 3 месяцев переливалась кровь.

3) Повторные эпизоды повышения температуры у человека, получающего терапию в соответствии с окончательным диагнозом (установленный диагноз – любое заболевание, кроме малярии).

4) Сохранение лихорадки в течение 3 дней в эпидемичный период и более 5 дней в остальное время.

5) Наличие определенных симптомов (одного или нескольких) у людей, которые в течение последних 3 лет посещали эндемичные страны:

• лихорадка;
• недомогание;
• озноб;
• увеличение печени;
• головная боль;
• увеличение селезенки;
• снижение гемоглобина;
• желтушность кожи и слизистых;
• наличие герпетических высыпаний.

Для верификации диагноза могут применяться различные методы лабораторного обследования:

1. Микроскопическое изучение мазков крови (позволяет непосредственно обнаружить малярийный плазмодий).
2. Экспресс-тест.
3. ПЦР-исследование (изучение генетического материала путем многократного получения копий ДНК малярийного плазмодия при его присутствии в крови).
4. Биохимический анализ производится для установления степени тяжести заболевания (определяет выраженность поражения печени, которое наблюдается всегда при малярии).

Всем пациентам с подтвержденным диагнозом малярии показано проведение и ряда инструментальных исследований. Их результаты помогают врачу выявить возможные осложнения и вовремя начать их лечение.

Рекомендованы следующие исследования:

• ультразвуковое сканирование брюшной полости (особое внимание уделяют размерам печени, почек и селезенки);
• электрокардиограмма;
• рентгенография легких;
• эхокардиоскопия;
• нейросонография;
• электроэнцефалография.

На малярию необходимо сдать

, а также общие и специфические анализы крови, которые помогут диагностировать это заболевание.

При подозрении на малярию необходимо сдать общий анализ мочи. Результаты анализа могут указать на появление крови в моче больного.

Показателями, указывающими на присутствие крови в моче больного малярией, являются:

• красноватый цвет мочи;
• появление эритроцитов (красных кровяных клеток) в моче;
• появление свободного гемоглобина (белка, придающего эритроцитам красный цвет) в моче;
• выделение сгустков крови с мочой (гематурия).

Особенно информативны при малярии

, которые указывают на присутствие паразита в организме человека. Для его выявления необходимо сдавать анализы крови в период выраженных клинических проявлений. При малоинформативных результатах забор крови производится каждые 5 – 6 часов на протяжении суток.

Общие и специфические анализы крови, которые необходимо сдавать при малярии

Гемолейкограмма

Все анализы крови начинаются с гемолейкограммы. При малярии разрушаются в большом количестве эритроциты, что приводит к появлению сдвигов в общем соотношении клеточных элементов крови.

Основными отклонениями в гемолейкограмме при малярии являются:

• снижение показателя эритроцитов (меньше 3,5 – 4 триллионов клеток в литре крови);
• снижение показателя гемоглобина (меньше 110 — 120 грамм в литре крови);
• уменьшение среднего объема эритроцита (меньше 86 кубических микрометров);
• увеличение показателя тромбоцитов (больше 320 миллиардов клеток в литре крови);
• увеличение показателя лейкоцитов (больше 9 миллиардов клеток на литр крови).

Биохимический анализ крови

При малярии также необходимо сдать

, который подтверждает активное разрушение эритроцитов в сосудистом русле.

Основными изменениями в биохимическом анализе крови при малярии являются:

• повышение уровня прямого билирубина (выше 7,9 микромоль на литр);
• повышение уровня непрямого билирубина (выше 19 микромоль на литр);
• рост уровня альбумина (больше 52 грамм на литр);
• повышение активности АЛТ – фермента , отвечающего за оценку работы сердца (более 40 единиц на литр);
• повышение активности АСТ – фермента, отвечающего за оценку работы печени (более 40 единиц на литр).

Анализ крови с микроскопией (

изучением под микроскопом

) необходимо сдать для обнаружения самих малярийных паразитов.

При микроскопии толстой кровяной капли обнаруживаются большие относительно бледные эритроциты, в которых находятся плазмодии малярии в различных стадиях развития. Их количество в периферической крови зависит от тяжести заболевания.

Микроскопия тонкого мазка крови позволяет более детально изучить измененные эритроциты и паразитов в частности. Такой анализ назначается для определения вида паразита и его стадии развития.

Иммунологический анализ крови

Для обнаружения малярийных антигенов (

) необходимо сдать кровь на иммунологический анализ. Существует несколько экспресс-тестов на различные виды плазмодий, которые позволяют диагностировать болезнь прямо у кровати больного. Выполнение иммунологических тестов занимает 10 – 15 минут. Этот анализ широко используется для эпидемиологических исследований в странах с высоким риском заражения малярией.

Серологический анализ крови

При малярии необходимо сдать серологический анализ крови, чтобы обнаружить антитела к плазмодиям в крови пациента. Результаты этого анализа могут указывать не только на присутствие паразита в организме, но и на перенесенное заболевание. Положительным результатом считают рост концентрации антител в крови более чем 1 к 20.

Полимеразная цепная реакция на основе капли крови

ПЦР при малярии необходимо сдавать, только если предыдущие анализы не подтвердили заболевание. ПЦР выполняется на основе капли периферической крови заболевшего человека. Данный вид анализа является высокоспецифичным. Он дает положительный результат и обнаруживает возбудителя в более чем 95 процентах случаев болезни.

Адекватное лечение малярии возможно лишь под наблюдением врача инфекциониста. Для адекватного контроля эффективности лечения необходимо периодически производить

Лечить малярию необходимо только после лабораторного подтверждения диагноза. Без паразитологического доказательства заболевания можно провести лечение, во-первых, при наличии клинических симптомов в очагах эндемических по малярии, во-вторых, при недоступности лабораторных методов исследования. Лечение проводят в условиях инфекционного стационара.

• Прервать жизнедеятельность паразита в крови больного.
• Предотвратить появление осложнений заболевания.
• Не допустить смерть больного.
• Профилактика хронического течения и рецидивов малярии.
• Уменьшить резервуар возбудителя, профилактика дальнейшего распространения паразита.
• Профилактика выработки устойчивости плазмодия к противомалярийным препаратам.

• Специфическое (противомалярийное, медикаментозное) – основное этиотропное лечение (направлено на возбудителя).
• Симптоматическая и патогенетическая терапия (используется при осложненных формах малярии).
• Режим ухода за больным.

Медикаментозное лечение малярии

В зависимости от вида малярии, наличия или отсутствия осложнений заболевания, стадии цикла развития малярийного плазмодия, наличия устойчивости (резистентности) к противомалярийным препаратам, разрабатываются индивидуальные схемы этиотропной терапии из представленных противомалярийных препаратов.

Лечение малярии начинается в 2-х случаях:

• при подтверждении диагноза лабораторными методами исследования;
• при подозрении на заболевание в связи с наличием эпидемиологических и клинических показаний.

1. Борьба с острыми проявлениями заболевания и обеспечение клинического эффекта.
2. Назначение гемашизотропных препаратов при четырехдневной и тропической малярии и гистошизотропных препаратов при трехдневной и овале-малярии с целью предупреждения рецидивов заболевания.
3. Назначение препаратов, эффективных в отношении гаметоцитов (первичных половых клеток) с целью обеспечения эпидемиологического эффекта.
4. В схеме лечения необходимо предусмотреть симптоматическую и патогенетическую терапию. Обязательным компонентом комплексного лечения должна быть общеукрепляющая терапия.

Радикальное лечение малярии предполагает полное избавление организма от возбудителей заболевания.

Наиболее эффективной схемой лечения малярии является комбинация Акрихина, Плазмоцида и Бигумаля. При ее использовании быстро достигается полный терапевтический эффект, ликвидируется гаметоносительство и сокращается до минимума число рецидивов. Из-за развития побочного действия противомалярийных препаратов лечение больных необходимо проводить в стационаре.

1. Радикальное лечение трехдневной и овале-малярии проводится 2-я препаратами: гематошизотропным препаратом Делагил в течение 3-х дней и гистошизотропным препаратом Примахин в течение 14 дней.
2. При развившейся резистентности малярийных плазмодиев к Хлорохину и его производным лечение проводится Хлоридином в течение 3 — 6 дней и сульфаниламидными препаратами в течение 7 дней. Можно использовать сочетание Хинина с Тетрациклином или сульфаниламидными препаратами. Используется препараты глубокого резерва Мефлохин или Галофантрин.
3. При тяжелых формах малярии производные Хлорохина дифосфата вначале вводятся внутривенно или внутримышечно, а в последующем осуществляется переход на пероральный прием.
4. С целью предупреждения развития поздних рецидивов воздействие на дремлющие формы P. vivax- и Р. оvalе осуществляется путем приема Примахина и Хиноцида.
5. С целью проведения общественной профилактики в эндемичных по малярии регионах в период перед началом передачи возбудителей в течение 14 дней показан прием гамонтотропного препарата Примахина дифосфата, который препятствует развитию спорозоитов в теле комара.

В очагах, где высокая интенсивность передачи паразитов, радикальная терапия P. vivax- и Р. ovale-малярии не целесообразна.

При лечении 4-х дневной малярии применяется только один гематошизотропный препарат. Препаратом выбора в данном случае является Хлорохин дифосфата в течение 5 дней. В эпидемический сезон Хлорохин применяется вместе с гамонтотропным препаратом Примахином в течение 3-х дней.

Противорецидивное лечение проводится через 1,5 — 2 месяца после завершения основного курса лечения. Для его проведения можно использовать те же противомалярийные препараты, что применялись ранее, но доза при этом уменьшается на 1/3. Далее противорецидивное лечение проводится через год: в апреле при 3-х дневной малярии, в августе — сентябре — при тропической малярии.

Своевременно начатая адекватная химиотерапия всегда гарантирует успех противомалярийного лечения.

При установлении диагноза
тропической малярии на основании эпидемиологического анамнеза и
клинической картины противомалярийное лечение начинают немедленно
после взятия крови, не дожидаясь результатов паразитологического
исследования.

Экстренность лечения особо необходима при заболевании
детей малого возраста, беременных, приезжих в очаг неиммунных лиц.
Эффективность лечения определяется обеспеченностью пункта первой
помощи противомалярийными препаратами (см.

ниже). Больному назначают
внутрь, при тяжелом состоянии — парентерально однократную дозу
хинина или делагила (приложения 1, 2, 3).

Если медицинское
учреждение располагает всеми средствами лечения тропической
малярии, его проводят на месте. При отсутствии условий больного
перевозят в специализированный стационар, обеспечивая
медикаментозными средствами на период транспортировки.

В полевых
условиях лечение проводят на месте с использованием всех доступных
средств. Этиотропная и патогенетическая терапия проводится
одновременно.

Лечение пациентов с малярией проводится только в стационаре. Основными целями терапии являются:

• предупреждение и ликвидация острых приступов заболевания;
• предупреждение осложнений и их своевременная коррекция;
• профилактика рецидива и носительства малярийных плазмодиев.

Всем больным сразу же после установления диагноза рекомендован постельный режим и назначение противомалярийных средств. К ним относятся:

• Примахин;
• Хлорохин;
• Мефлохин;
• Пириметамин и другие.

Одновременно показано применение жаропонижающих и симптоматических препаратов. Они достаточно многообразны ввиду полиорганности поражения. Поэтому к лечению часто привлекаются врачи разных специальностей, а не только инфекционисты.

В терапевтическом процессе важно проводить динамическое исследование крови для выявления степени паразитемии. Этот показатель помогает оценить успешность лечения. Оно считается удовлетворительным, если:

• через 24 часа паразитемия уменьшилась на 25%;
• через 48-72 часа – ее уровень не более 25%.

В тех случаях, когда этого не происходит, требуется смена противомалярийного препарата. Она также показана и тогда, когда на 4-й день в крови обнаруживаются плазмодии. Это может указывать на возможную фармакологическую резистентность. Она повышает риск отдаленных рецидивов.Если все идет гладко, то чтобы окончательно подтвердить излеченность, определяются специальные критерии. К ним относятся:

• нормализация температуры;
• уменьшение селезенки и печени до нормальных размеров;
• нормальная картина крови – отсутствие в ней бесполых стадий малярийных плазмодиев;
• нормальные показатели биохимического анализа крови, свидетельствующие о восстановлении функции печени.

Против малярии существует широкий спектр различных лекарств, которые действуют на различные стадии развития малярийного плазмодия. В первую очередь применяются этиотропные препараты, действие которых направлено на уничтожение малярийного плазмодия из организма. На второй план выходят препараты, действие которых направлено на устранение симптомов (

Существуют различные таблетки от малярии в зависимости от основного действующего вещества.

Основными лекарственными группами таблеток от малярии являются:

• хинолин метаноловая группа (хинина сульфат, хлорохин, гидроксихлорохин, примахин);
• бигуаниды (прогуанил);
• диаминопиримидиновая группа (пириметамин);
• сульфаниламидная группа (сульфадоксин);
• сульфоны (дапсон);
• тетрациклиновая группа ( тетрациклин );
• линкосамиды (клиндамицин).

Хинолин метаноловая группа

Существует несколько групп противомалярийных препаратов. Их градация основана на воздействии на ту или иную стадии развития малярийных плазмодиев в организме больного.

При укусе инфицированного малярийного комара в течение 10 — 30 минут брадиспорозоиты оседают в клетках печени. Часть тахиспорозоитов Plasmodium ovale и Plasmodium vivax и все тахиспорозоиты Plasmodium falciparum и Plasmodium malariaе немедленно начинают печеночную шизогонию.

Другая часть брадиспорозоитов Plasmodium ovale и Plasmodium vivax впадают в спячку и в дальнейшем являются причиной поздних рецидивов. Гистошизотропные препараты оказывают действие на малярийных плазмодиев, проходящих преэритроцитарный (печеночный) путь развития.

Они подавляют развитие тканевых форм паразитов и препятствуют развитию поздних рецидивов.

• На преэритроцитарные формы паразитов хорошо действуют Хлоридин и Прогуанил (Бигумаль).
• Для предупреждения отдаленных рецидивов показано применение Примаквина (Примахина) и Хиноцида.

Гематошизотропные препараты разрушают малярийные плазмодии, проходящие свой цикл развития в эритроцитах, купируют приступы малярии.

• В эту группу входят: Хинин, Мепакрин (Акрихин), Пириметамин (Хлоридин, Малоцид, Тиндурин, Дараприм), Хлорохин (Хингамин, Резохин, Нивахин и др.), Плазмохин.
• Помимо вышеуказанных препаратов для лечения малярии используются антибиотики и сульфаниламидные препараты (Триметоприм, Пириметамин, Сульфаметоксазол, Сульфадоксин, Тетрациклин, Клиндамицин, Мефлохин и фторхинолоны). Назначение производных сульфона и сульфаниламида позволяют значительно уменьшить дозы основных противомалярийных препаратов.
• Из комбинированных препаратов используется Фансидар — сочетание Пириметамина и Сульфадоксина.
• Препаратом глубокого резерва является Галофантрин.

Гамонтотропные препараты оказывают действие на гаметоциты — незрелые половые формы паразитов. Гамонтоцидной активностью обладают Примахин, Хиноцид, Бигумаль, Хлоридин, Плазмохин. Препараты этой группы используются для санации выявленных паразитоносителей, то есть с целью «общественной» химиопрофилактики малярии.

Малярийные плазмодии в организме инфицированного человека находятся на разных стадиях развития, поэтому при лечении заболевания используются сочетания препаратов разных групп.

Профилактика малярии необходима при проживании и временном пребывании в странах, эндемичных по малярии. Так что при поездке в неблагополучную по малярии страну нужно предварительно подготовиться. Беременным, детям в возрасте до 4-х лет и людям, живущим с ВИЧ, в страны, неблагополучные по малярии желательно не выезжать.

Перед поездкой рекомендовано проконсультироваться в посольстве страны, в которую планируется путешествие, относительно эпидемической ситуации и эффективных для этого региона мер профилактики малярии.

• Противомоскитные сетки на окнах и проемах дверей, можно спать под завесой из сетки, заправив ее под матрац.
• Репелленты – химические соединения, отпугивающие комаров, но не убивающие их, которые наносятся на кожу или одежду человека. Бывают различные формы: крема, спреи, аэрозоли, гели и т. п. Используются согласно инструкции.
• Инсектициды – средства для уничтожения комаров. Аэрозолем инсектицида рекомендовано обрабатывать помещения, сетки, пороги. Через полчаса после обработки необходимо проветрить помещение.

Используются противомалярийные препараты. Необходимо уточнить региональную устойчивость малярии к препаратам. Медикаментозная профилактика не обеспечивает 100% защиты, но значительно снижает риск заболевания.

Препараты, используемые для профилактики малярии

(необходимо начать принимать за 1 неделю до поездки и продолжать 4 – 6 недель после прибытия домой)

• Хлорохин (делагил) 0,5 г взрослым и 5 мг/кг/сут. детям 1 раз в неделю.
• Гидроксихлорохин (плаквенил) 0,4 г взрослым и 6,5 мг/кг детям 1 раз в неделю.
• Мефлохин (лариам) 0,25 г взрослым и 0,05 – 0,25 мг детям 1 раз в неделю.
• Примахин 30 мг взрослым и 0,3 мг/кг детям 1 раз в 48 ч.
• Прогуанил (бигумаль) 0,2г/сут. взрослым и 0,05-0,2 г детям.
• Приметамин(хлоридин) 0,0125 г взрослым и 0,0025 – 0,0125 г детям в сочетании с препаратом дапсон 0,1 г взрослым 1 раз в неделю.

Необходимо своевременно обследовать больных с подозрением на малярию, а также обязательно обследовать пациентов с каждым гипертермическим синдромом, прибывших из мест эндемичных по малярии в течение 3-х лет. Эффективное лечение способствует прекращению дальнейшей передачи возбудителя через комаров.

На данный момент официальная противомалярийная

отсутствует. Однако проводятся клинические исследования экспериментальной вакцины в отношении тропической малярии. Возможно, в 2015 — 2017 году данная вакцина поможет справиться с эпидемией малярии в мире.

Профилактике малярии туристы должны уделить пристальное внимание. Еще до путешествия в турфирме следует узнать, представляет ли страна опасность по данному заболеванию.

Если да, то следует заблаговременно посетить инфекциониста. Он порекомендует прием противомалярийных препаратов, которые защитят человека от заражения.

Специфической вакцины от малярии не существует.

Другими важными рекомендациями, помогающими предупредить заражение, являются:

• избегать нахождения на улице после 17.00, т.к. на это время приходится пик активности комаров;
• при необходимости выхода на улицу – закрывать тело одеждой. Особенно уделить внимание лодыжкам, куда чаще всего кусают комары, а также запястьям и кистям, где очень тонкая кожа;
• применение репеллентов.

Если ребенок маленький, то родителям стоит воздержаться от поездок в опасные страны. В детском возрасте прием противомалярийных препаратов не желателен, из-за частого развития побочных эффектов и гепатотоксичности. Поэтому родителям стоит взвешивать возможные риски.

Прививка от малярии существует, однако на сегодняшний день она не универсальна. Ее плановое использование не одобрено в европейских странах мира.

Первая прививка от малярии была создана в 2014 году в Великобритании фармацевтической компанией GlaxoSmithKline. Британские ученые создали препарат mosquirix (

москирикс

), который предназначен для вакцинации населения, наиболее подверженного риску заражения малярией. С 2015 года данная прививка используется для вакцинации детей многих стран Африки, где чаще всего встречается малярия.

Прививку москирикс делают детям от полутора месяцев до двух лет. Именно в этом возрасте африканские дети наиболее подвержены заражению малярией.

По данным ученых в результате прививания не у всех детей развивался иммунитет против малярии. У детей в возрасте от 5 до 17 месяцев заболевание было предотвращено в 56 процентах случаев, а у детей до 3 месяцев — только в 31 процентах случаев.

Таким образом, в настоящее время созданная прививка от малярии имеет ряд отрицательных качеств, что приостанавливает ее масштабное использование.

источник

Купить МУК 4.2.3222-14 — бумажный документ с голограммой и синими печатями. подробнее

Распространяем нормативную документацию с 1999 года. Пробиваем чеки, платим налоги, принимаем к оплате все законные формы платежей без дополнительных процентов. Наши клиенты защищены Законом. ООО «ЦНТИ Нормоконтроль».

Наши цены ниже, чем в других местах, потому что мы работаем напрямую с поставщиками документов.

• Срочная курьерская доставка (1-3 дня)
• Курьерская доставка (7 дней)
• Самовывоз из московского офиса
• Почта РФ

Методические указания регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер. Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций, индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.5. Окраска препаратов крови

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

5. Микроскопическая диагностика возбудителей малярии и бабезиозов

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов, возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием химиотерапевтических препаратов

5.5. Источники диагностических ошибок

5.6. Оценка интенсивности паразитемии

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля и направления результатов на подтверждение

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты).

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

Приложение 1. Необходимые реактивы и оборудование

Приложение 2. Возбудители паразитозов под воздействием противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях

Приложение 3. Элементы крови, контаминанты и образования, симулирующие малярийных паразитов

Приложение 4. Приготовление толстой капли на плёнке для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981)

Чтобы бесплатно скачать этот документ в формате PDF, поддержите наш сайт и нажмите кнопку:

Федеральная служба по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические указания МУК 4.2.3222-14

Л12 Лабораторная диагностика малярии и бабезиозов: Методические указания.—М.: ФБУЗ «Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора,— 43 с.

1. Разработаны Научно-исследовательским институтом медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е. И. Марциновского ГБОУ ВПО Первого Московского государственного медицинского университета (МГМУ) им. И. М. Сеченова (В. П. Сергиев. С. А. Рабинович. Е. Н. Морозов. Е. В. Максаковская. М. Н. Лебедева): кафедрой тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первого Московского государственного медицинского университета им. И. М. Сеченова (И. В. Кукина. Л. Ф. Морозова): Федеральной службой по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (Т. М. Гузеева): ГБОУ ДПО -Российская медицинская академия последипломного образования» Мин права России (М. С. Орлов); ФБУЗ -Федеральный центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора (Т. Г. Сыскова): ГБОУ ДПО РМАПО (А. Е. Беляев. Ю. П. Горбунова); Управлением Роспотребнадзора nor. Москве(Т. Н. Иванова); ФБУЗ-Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Н. И. Тимошенко): Инфекционной клинической больницей № 2 г. Москвы (В. Д. Сады ко ва).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 июня 2014 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А. Ю. Поповой 22 сентября 2014 г.

4. Разработаны взамен МУК 3.2.987—00 «Паразитологическая диагностика малярии».

© Федеральный центр гигиены

и эпидемиологии Роспотребнадзора. 2015

4.5.1. Приготовление рабочего раствора краски Романовского—Гимзы

Оптимальную концентрацию рабочего раствора и время окрашивания нужно подобрать самостоятельно, так как они зависят от качества маточного раствора краски и от температуры окружающей среды.

1. Маточный раствор краски Романовского—Гимзы (промышленного изготовления или приготовленный из сухой смеси) перемешать и обязательно профильтровать.

2. Непосредственно перед употреблением приготовить 5% (10%) рабочий раствор краски: к 95 (90) мл буферного раствора добавить 5 (10) мл маточного раствора краски (соответствует 1—2 каплям краски на 1 мл раствора).

3. Готовый рабочий раствор перемешать.

4. При необходимости ускорения получения ответа можно использовать 20 % раствор, сократив время окраски до 15—20 мин.

Рабочий раствор краски Романовского-Гимзы для окрашивания препаратов крови использовать в течение 1 ч!

Для определения качества маточного раствора краски Романовского-Гимзы каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Показатели качественного окрашивания. Правильно окрашенный препарат макроскопически имеет синий цвет с сиреневым оттенком, а при его микроско-пировании:

— ядра лейкоцитов фиолетового цвета с различной структурой хроматина;

— зернистость базофилов фиолетового цвета;

— зернистость эозинофилов оранжево-красного цвета;

— у моноцитов на фоне серо-голубой цитоплазмы может быть вишневокрасная зернистость;

— зрелые эритроциты — розового цвета с сероватым оттенком;

— тромбоциты — сиренево-розового цвета с ра зличимой сетчатостью.

Иногда в промышленных сериях маточного раствора краски Романовского-

Гимзы недостаточно а зура, что обусловливает слабое окрашивание азурофильных элементов (ядер малярийных паразитов, зернистости пораженных эритроцитов и лейкоцитов). Результаты окрашивания мазков и капель могут быть значительно улучшены при добавлении к рабочему раствору краски Романовского так называемой синьки Мэнсона, которую готовят заранее следующим образом: 1,5 г метиленового синего и 2.5 г буры растирают в ступке и добавляют к 100 мл дистиллированной воды. Для созревания флакон с краской оставляют на 10—12 дней при комнатной температуре. Процесс созревания можно ускорить, поместив флакон на водяную баню на 40—60 мин при 60—80 *С.

Синька Мэнсона при хранении в темном сухом месте пригодна к использованию в течение многих лет. Количество краски Мэнсона. добавляемое к рабочему раствору краски Романовского-Гимзы, устанавливают опытным путем: нередко достаточно добавить к 1 л рабочего раствора несколько капель краски.

4.5.2. Способы окрашивания и промывки тонкого мазка и толстой капли по Романовскому—Гимзе

Окрашивание препаратов крови, в зависимости от их количества, можно проводить двумя способами:

1. Препараты крови вертикально помешают в специальные ванночки или контейнеры, без соприкосновения друг с другом. Затем наливают рабочий раствор краски. Данный способ окраски наиболее приемлем, когда есть необходимость окраски большого количества препаратов крови. В стандартном контей-

нере можно окрасить 20 препаратов при вместимости 90 мл краски. Повторно использовать краску нельзя.

2. Препараты располагают горизонтально (мазками вверх) на рельсах, лежащих на кюветах. Осторожно наносят краску. Этот способ окраски чаще применяют при окрашивании небольшого количества препаратов крови. Расход рабочего раствора краски составляет примерно 4 мл на I препарат. Вместе с тем. при таком способе есть риск выпадения осадка, что может затруднить микроскопию.

Время окрашивания зависит от температуры окружающей среды и концентрации рабочего раствора краски. Так. например, при температуре 20—23 в С тонкий мазок окрашивают 40—50 мин, толстую каплю — 20—25 мин 10 %-м раствором краски. При менее высокой температуре время окрашивания увеличивают. При очень высокой температуре (около 30 °С) время окрашивания капель, но не мазков. может быть сокращено до 15 мин. Толстые капли, предварительно обработанные забуференным раствором метиленового синего, окрашивают 6—10 мин.

Препараты крови на малярию окрашивают и исследуют немедленно после взятия в режиме «ОТО!*

Промывку тонких мазков, фиксированных до окраски, проводят под струей проточной воды из пипетки или погружением в емкость.

При промывке толстых капель необходима осторожность, так как капли могут оторваться от стекла. Кроме того, на поверхности раствора образуется оксидная плёнка, которая при сливании краски неизбежно останется на препарате. По этой причине необходимо не выливать краску из контейнера, но вытеснять её. подставив контейнер под слабую струю воды. При окраске на рельсах препарат, не сливая краску, медленным движением погружают в емкость с чистой водой 1—2 раза и высушивают в вертикальном положении.

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови

Препараты крови исследуют под микроскопом с применением масляной иммерсии: объектив х90 или х100, окуляр х7, х8 или х10. с поднятым конденсором и полностью открытой диафрагмой.

С диагностической целью сначала ми крое копируют толстую каплю, затем, при необходимости, для уточнения вида возбудителя — тонкий мазок.

Правильно приготовленная и окрашенная толстая капля должна иметь светлый фон без нитей фибрина и осадка краски.

При нормальной толщине капли в каждом поле зрения должно быть 10—15 лейкоцитов. Обязательно нужно просмотреть краевую зону, более тонкую часть толстой капли, где эритроциты не полностью гемолизированы и может сохраниться неизмененная морфология паразита и пораженного эритроцита, что облегчит дифференциальный диагноз. Если вероятность малярии у пациента велика, а паразиты не выявляются, повысить эффективность выявления паразитов лучше просмотрев вторую каплю, а не увеличивая время просмотра той же самой капли. Унифицировать время просмотра толстой капли невозможно, так как оно зависит от опыта микроскоп иста, качества препарата и др.

Препарат считается отрицательным, если паразиты не обнаружены после просмотра 100 полей зрения толстой капли. 0|рицагелы1ый диагноз не может считаться достоверным, если исследован только тонкий мазок.

При отрицательном первичном результате, но высокой вероятности (анамнестических, эпидемиологических, клинических показаниях) наличия малярии у пациента кровь исследуют повторно через 6—12—24 ч. При плохом качестве приготовления толстой капли исследование крови повторить немедленно.

После первого обнаружения паразитов исследование продолжают для того чтобы:

— определить видовую принадлежность паразитов;

— указать, какие стадии паразитов найдены (только в случае Р. falciparum);

— указать наличие или отсутствие гаметоцитов в случае тропической малярии;

— указать количество паразитов, руководствуясь одним из предлагаемых ниже методов;

— не пропустить смешанную инфекцию.

В тонком мазке для обнаружения малярийных паразитов исследуют участок, где эритроциты расположены в один слой — бахромчатую и прилегающую к ней зону — так называемый хвост препарата.

При просмотре тонкого мазка используется метод «зубчатая стена»: просмотр края мазка последовательными вертикально-горизонтальными передвижениями препарата.

Определение вида основано на совокупности ряда признаков как самого паразита. так и пораженного эритроцита.

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии

Последовательность установления диагноза при малярии следующая:

— решается вопрос, есть ли паразиты;

— решается вопрос, не Р. falciparum ли это;

— находят характерные стадии, позволяющие дифференцировать три остальных вида;

— если установлено, что речь идёт о Р. falciparum. решают, присутствуют ли гаметоциты.

Кольцевидные и амебовидные трофозоиты

Кольца обычно немногочисленны. крупнее, чем у Р.falciparum.

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. В периферической крови могут быть обнаружены все формы эритроцитарной шизогонии. Интенсивность паразитемии редко превышает 20 тыс. паразитов в 1 мкл крови. При нарастании паразитемии синхронность утрачивается, характерен полиморфизм — одновременное наличие разных возрастных стадий бесполых форм паразита и гаметоцитов. Встречается поражение одного эритроцита несколькими паразитами, но реже и в меньшей степени, чем в случае Р. falciparum. Пораженные эритроциты увеличиваются тем больше, чем старше паразит, иногда в 1.5 раза. По мере развития паразита эритроцит обесцвечивается, иногда приобретает неправильную форму, на поверхности эритроцита появляется мелкая, обильная, неравномерная азурофильная зернистость, так называемая зернистость Шюффнсра.

Мерозоиты. внедрившиеся в эритроциты. преимущественно в незрелые, превращаются в юные кольцевидные грофозоиты.

Более юные занимают !/б пораженного эритроцита, более взрослые — У4- Ядро округлое, реже несколько вытянутое, относительно плотное. Вакуоль хорошо выражена. В цитоплазме у растущих колец нередко появляются утолщения в одном из участков. Пигмент — отдельные нежные мелкие зерна, темно-коричневые.

У наиболее молодых ядро и цитоплазма резко уплотняются; цитоплазма в виде комочка, иногда несколько изогнутой формы, напоминает в сочетании с ядром «запятую». У несколько более крупных колец цитоплазма разрывается на удлиненные полоски, которые в сочетании с ядром могут напоминать «восклицательный знак», «ласточку». При обнаружении в препарате только единичных юных колец определение вида паразита затруднено.

Амебовидные трофозоиты. Цитоплазма разорвана на фрагменты разного размера, располагающиеся вблизи ядра. Редко сохраняется вакуоль.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола, иногда с различимой зернистостью Шюффнера, на периферии капли или на тонком мазке крови при приготовлении толстой капли на тонком мазке. Это так называемые тени, выраженность которых зависит от достаточного содержания азура в краске.

Амебовидные трофозоиты занимают 1/з— 1/2 эритроцита, более зрелые — его значительную часть. Ядро круглое или овальное, крупнее и менее плотное в сравнении с кольцевидными трофозоитами, расположено периферически. Цитоплазма разнообразной формы с псевдоподиями, отражающими присущую этим стадиям амебоидную активность — это определило название вида паразита (viva означает живой, подвижный). Наиболее молодые имеют несколько длинных тонких псевдоподий, количественно увеличивающихся по мере роста, придавая паразиту причудливую форму. Пигмент — отдельные нежные зерна темно-коричневого цвета, в разных участках цитоплазмы. Вакуоль относительно крупная, встречается так называемая добавочная вакуоль — артефакт, результат слияния концов двух псевдоподий при приготовлении и последующей фиксации мазка крови. Пигмент темно-коричневый. расположен чаще диффузно в цитоплазме, иногда концентрируется вокруг вакуоли или по периферии паразита. По мере роста паразита вакуоль постепенно уменьшается, псевдоподии сглаживаются.

Развивающиеся и зрелые трофозоиты

В толстой капле развивающиеся трофозоиты разнообразной фор-

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии юных колец эритроцит почти не увеличен, появляются мелкие, едва различимые единичные зерна Шюффнера. На стадии более молодых амебовидных трофозоитов размеры эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера нарастают.

Развивающиеся трофозоиты. Утрачивают псевдоподии, округляются, уменьшается размер вакуоли, увеличивается масса ядра и

цитоплазмы. Пигмент становится более выраженным и обильным.

Зрелыетрофозоиты. Занимают значительную часть сильно увеличенного эритроцита, форма округлая или овальная без псевдоподий и вакуоли. Ядро относительно крупное, рыхлое, чаше несколько вытянутое, иногда дугообразное. Цитоплазма занимает основную часть эритроцита. Пигмент хорошо выражен, расположен диффузно или концентрируется по периферии паразита, может группироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. На стадии развивающихся и зрелого трофозои-та увеличение эритроцита достигает максимального размера с четко рахпичимой зернистостью Шюффнера.

мы и размера. Цитоплазма обычно разорвана, в зависимости от возраста паразита около ядра концентрируются 2 и более фрагментов цитоплазмы. Иногда сохраняется большая вакуоль. Зрелые трофозоиты сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но резко сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты. толстая капля).

Развивающиеся (незрелые) шизонты

Развивающиеся шизонты округлой или овальной формы, без вакуоли и псевдоподий занимают значительную часть эритроцита. В неразделившейся цитоплазме от 2 ядер, уменьшающихся в размере и увеличивающихся в количестве по мере их деления. Пигмент начинает концентрироваться в отдельные скопления.

Состояние пораженных эритроцитов. Максимально выражено увеличение пораженного эритроцита и интенсивность зернистости Шюффнера.

Нашивающиеся шизонты. Сохраняют особенности морфологии «тонкого мазка», но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).

Зрелые шизонты. Занимают почти весь или весь эритроцит. Содержат 14—18 (в среднем 16) относительно мелких мерозои-тов, расположенных асимметрично по отношению к пигменту, собранному в одно плотное скопление. Мерозоит конической

Зрелые шизонты. Сохраняют особенности морфологии тонкого мазка, но сжимаются.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в

или овальной формы не свыше 2 мкм в диаметре, ядро мелкое и плотное, расположено апикально.

виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля)

Сегментоядерный лейкоцит и тромбоциты представлены для сопоставления масштаба.

Состояние пораженных эритроцитов. К моменту образования мерозоитов. пораженный эритроцит разрывается, в отдельных случаях может еше сохраняться с видимой зернистостью Шюффнера.

Женские гаметоциты округлые, компактные, не всегда отличимы от зрелых трофозоитов.

Мужские гаметоциты легко распознаются в результате особенности их деформации в толстой капле. Ядро уплотняется и превращается в относительно крупное округлое образование. Цитоплазма также уплотняется и как «венчик» окружает ядро. На фоне цитоплазмы четко выявляются многочисленные зерна пигмента.

Состояние пораженных эритроцитов. Остатки пораженных эритроцитов могут сохраняться в виде розового ореола (см. выше, кольцевидные и амебовидные трофозоиты, толстая капля).

Женские гаметоциты. Округлые или овальные занимают весь пораженный эритроцит. Ядро относительно плотное, округлое или вытянутое, расположено асимметрично, реже в центре клетки. Размер ядра варьирует. Периферия ядра иногда окрашена менее интенсивно, создавая «зону просветления».

Цитоплазма окрашена в более интенсивный сине-голубой цвет в сравнении с бесполыми формами, вакуоли нет. Пигмент — обильный, мелкие интенсивно окрашенные гранулы или грубые зерна, рассеянные по цитоплазме, имеющие более коричневый оттенок в сравнении со зрелыми трофозоитами. Женские гаметоциты иногда трудно дифференцировать со зрелыми трофозоитами.

Мужские гаметоциты. Несколько уступают в размерах женским гаметоцитам. Ядро крупное, рыхлое с просветлениями, без четких границ, диффузное, иногда различимо с трудом. Имеет более светлую или яркую окраску в сравнении с женским гаметоци-том. Иногда на фоне ядра обнаруживаются отдельные скопления хроматина, имеющие более интенсивную окраску. Цитоплазма с розовым оттенком. Пигмент — мелкие обильные гранулы или грубые зерна яркой коричневой окраски, рассеяны по цитоплазме с тенденцией к концентрации вокруг ядра.

Состояние пораженных эритроцитов.

Эритроцит увеличен, по периферии паразита видна зернистость Шюффнера.

Общая характеристика. Продолжительность эритроцитарной шизогонии — 48 ч. При неосложненном течении в периферической крови обнаруживаются

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов. 5

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики

4.1. Подготовка предметных стекол . 5

4.2. Приготовление и хранение реактивов. 6

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию. 7

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация. 7

4.5. Окраска препаратов крови. 10

4.6. Микроскопия окрашенных препаратов крови. 12

5. Микроскопическая диагностика возбудителей мазярии и бабезиозов. 13

5.1. Морфологические признаки возбудителей малярии. 13

5.2. Алгоритм просмотра препаратов крови на малярию. 24

5.3. Изменения морфологии паразита и пораженных эритроцитов,

возникающие в процессе приготовления и окраски препаратов крови. 25

5.4. Изменения морфологии паразита, связанные с воздействием

химиотерапевтических препаратов. 25

5.5. Источники диагностических ошибок. 26

5.6. Оценка интенсивности паразитемии. 26

5.7. Учет результатов исследования и оформление ответа. 28

5.8. Порядок исследования препаратов крови, контроля

и направления результатов на подтверждение. 29

5.9. Паразитологический контроль за эффективностью лечения. 31

5.10. Морфологические признаки возбудителей бабезиозов. 32

6. Иммунохроматография в лабораторной диагностике (экспресс-тесты). 34

7. Полимеразная цепная реакция (ПЦР). 35

npiuoxcemie I. Необходимые реактивы и оборудование. 37

Прнюжение 2. Возбудители паразитозов под воздействием

противомалярийных препаратов в тонких мазках и толстых каплях. 38

Прнюжение 3. Элементы крови, контаминанты и образования.

симулирующие малярийных паразитов. 41

Пртожение 4. Приготовление толстой капли на плёнке

для создания учебных коллекций по А. Е. Беляеву (1981). 42

Руководитель Федератьной службы по надзору в сфере зашиты прав потребителей и благополучия человека. Главный государственный санитарный врач Российской Федерации

4.2. МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

Методические у казания МУК 4.2.3222-14

1. Методические указания (далее — МУК) регулируют порядок применения метода отбора проб и методов лабораторных исследований биологического материала людей с целью обнаружения возбудителей малярии и бабезиозов, определения их видовой принадлежности, и носят рекомендательный характер.

2. Методические указания предназначены для специалистов паразитологических, микробиологических лабораторий Роспотребнадзора, медицинских организаций. индивидуальных предпринимателей, а также научно-исследовательских институтов, осуществляющих лабораторную диагностику малярии и бабезиозов.

Возможность завоза малярии на территорию Российской Федерации, появление вторичных от завозных, а также местных случаев заболевания требует своевременной лабораторной диагностики, необходимой для лечения и рационального проведения противоэпидемических мероприятий.

Неспецифические клинические проявления малярии, преимущественно в первые дни болезни, при наличии ряда объективных показателей эпидемиологического характера (географический анамнез — пребывание на территории стран с тропическим и субтропическим климатом) и клинического характера (лихорадочное состояние неясной этиологии, анемия, увеличение селезенки) обязывают врачей лечебно-профилактических организаций заподозрить малярию. Безусловным подтверждением диагноза служит обнаружение малярийного паразита при микроскопическом исследовании крови. Особое значение имеет раннее выявление возбудителя тропической малярии, при несвоевременной диагностике которой возможен летальный исход. Определение вида паразита служит основанием для выбора рациональной терапии и правильной организации противоэпидемических мероприятий.

Диагностика возбудителей бабезиозов вводится в целях дифференциальной диагностики с возбудителями малярии, в частности, с Р. falciparum. Поскольку, несмотря на различия в жизненном цикле возбудителей малярии и бабезиозов. они имеют ряд близких особенностей по морфологии некоторых стадий развития возбудителей в эритроцитах и по клиническим проявлениям инфекции. Ошибочная диагностика может привести к летальному исходу.

3. Методы лабораторной диагностики малярии и бабезиозов

Диагностика малярии основана на обнаружении кровяных форм паразитов (трофозоиты, шизонты и гаметоциты) при микроскопическом исследовании крови. В настоящее время не предложено способов обнаружения гипнозоитов: ни иммунологических, ни паразитологических. Для обнаружения эритроцитарных форм плазмодиев и определения их вида используют препараты крови, приготовленные методом тонкого мазка и толстой капли, окрашенные по методу Романовского-Гимзы. Оба метода, имеющие свои преимущества и недостатки, являются взаимодополняющими.

Основной метод — толстая капля. В толстой капле форменные элементы располагаются многослойно. В результате за один и тот же промежуток времени просматривается количество крови в 30—40 раз большее, чем в тонком мазке, что значительно повышает шанс обнаружения паразитов, особенно при низкой пара-зитемии. Чувствительность метода толстой капли такова, что при просмотре 100 полей зрения можно обнаружить паразитов при их численности около 8 в 1 мкл крови. Начинать надо всегда с просмотра толстой капли.

Толстую каплю окрашивают нефиксированной; это приводит к гемолизу эритроцитов, в результате чего паразиты становятся доступными для выявления. Однако при этом паразиты подвергаются деформации.

Толстая капля может позволить выявить и других паразитов крови: бабезий. трипаносом, микрофилярий. спирохет. В тонком мазке, фиксированном до окраски. сохраняются морфологические особенности, присущие данному виду паразита, и характерные изменения пораженного эритроцита. Тонкий мазок крови делают в дополнение к толстой капле.

Дифференциальное определение вида малярийного паразита проводят по совокупности признаков: морфологии паразита, состоянию пораженных эритроцитов, соотношению стадий паразита, обнаруженных в периферической крови.

Кроме того, в настоящее время широко используются для лабораторной диагностики малярии иммунологические (экспресс-тесты) и молекулярно-биологические методы. Данные методы являются взаимодополняющими, но «золотым» стандартом остается метод микроскопии толстой капли.

Основным методом диагностики бабезиозов является микроскопическое исследование препаратов крови — толстой капли и тонкого мазка. Однако при диагностике инфекции В. microti, характеризующейся низкой или субмикроскопической паразитемией, одна микроскопия при отрицательном результате может создать ложное представление, поэтому применяют и другие методы. Проводится иммунологическое исследование для обнаружения специфических антител с применением иммунофлюоресцентной методики (РИФ), а также молекулярнобиологическим методом — полимеразной цепной реакцией (ПЦР), позволяющей выявить единичные особи паразита. Для выявления низкой и субмикроскопической паразитемии проводится заражение хомяков кровью больного — изодиагностика; заболевание хомяков наступает спустя 1—4 недели.

4. Техника паразитологической (микроскопической) диагностики малярии и бабезиозов

4.1. Подготовка предметных стекол

Стекла, многократно бывшие в употреблении, для приготовления препаратов крови использовать запрещается, так как имеющиеся на них царапины могут затруднить диагностику и даже привести к диагностическим ошибкам.

Следует пользоваться только новыми стёклами и. предпочтительно, очищенными при изготовлении (precleaned) и готовыми к употреблению.

Использование новых стекол рентабельнее, так как устраняется трудоёмкий ручной процесс и гарантируется качество.

Если новые стёкла поставлены неочищенными, то их очищают следующим образом:

1. Новые предметные стекла замачивают в мыльном растворе, нагретом до 60 в С, не кипятят.

2. Каждое предметное стекло протирают ветошью с обеих сторон в этом растворе.

3. Промывают в проточной воде в течение 2—Зч, периодически перемешивая.

4. Погружают в дистиллированную воду на 30 мин; при отсутствии возможности протереть стекла в тот же день, их оставляют в холодильнике в дистиллированной воде до следующего дня.

5. Качество отмывки предметных стекол от щелочи проверяют нанесением на предметное стекло 1 капли фенолфталеина — появление розовой окраски раствора свидетельствует о недостаточной отмывке от щелочи.

6. Стекла вытирают чистой хлопчато-бумажной тканью и помещают для обезжиривания в смесь Никифорова (из расчета 1 мл смеси на 1 стекло) или спирт 70% где они могут храниться в течение длительного времени.

7. Извлеченные пинцетом из смеси Никифорова стекла протирают хлопчатобумажной материей, заворачивают в чистую гладкую не ворсистую бумагу небольшими партиями, оптимально по 6 штук — на одного больного.

Во время манипуляций с чистыми предметными стеклами их следует брать только за боковые поверхности или пинцетом.

4.2. Приготовление и хранение реактивов

4.2.1. Раствор краски Романовского-Гимзы

Маточный раствор краски Романовского-Гимзы представляет собой густую темно-фиолетовую жидкость, которую можно хранить в течение срока годности в сухом, защищенном от света, прохладном месте (но не в холодильнике). Для определения качества маточного раствора краски Романовского каждой новой серии производят пробное окрашивание препаратов крови.

Рабочий раствор краски Романовского готовят непосредственно перед употреблением из маточного раствора. Рабочий раствор должен быть использован в течение 1 ч, хранить его нельзя. Для текущей работы перед приготовлением рабочего раствора краски Романовского-Гимзы необходимое количество маточного раствора краски отливают в небольшой флакон, обязательно фильтруя через бумажные фильтры, так как при хранении маточного раствора может выпасть осадок. Этот раствор безводный и портится от попадания воды, поэтому не следует отбирать его пипеткой из-за риска контаминации водой, а следует отливать через горлышко.

1. Дистиллированная вода — 1 л.

2. Фосфат калия однозамещенный безводный — КН₂Р0₄ — 0,27 г.

3. Фосфат натрия двузамещенный безводный — Na₂HP0₄ — 0,67 г.

1. Соли растворить в дистиллированной воде (*/з объема) комнатной температуры, после полного растворения довести до метки 1,0 л.

2. Приготовленный раствор должен иметь pH (7.0 ± 0.2). Точное соблюдение требуемой реакции буфера важно для правильной окраски. Если pH 7.2. то добавляется КН₂Р0₄. Количество реактивов. необходимых для доведения pH. подбирают опытным путем.

Лучше использовать готовые таблетки фосфатного буфера (диапазон pH 7.0— 7,2).

Буферный раствор следует хранить в хорошо закупоренной посуде в холодильнике (до 1 месяца). Нельзя использовать старый буферный раствор с осадком или зазеленевший от развития водорослей. При искажении цвета окрашенных элементов крови следует проверить pH буферного раствора.

4.3. Взятие проб крови для исследования на малярию

1. Кровь для паразитологического исследования берут из пальца руки (у взрослых — обычно безымянного, у детей — из большого), у новорождённых детей — из большого пальца ноги (но не мочки уха!). Использовать венозную кровь можно только в случаях, если известно, что в качестве антикоагулянта применяли ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), другие антикоагулянты, такие как гепарин, цитрат, не должны быть использованы, так как они могут влиять на морфологию паразитов.

2. Периферическую кровь для исследования берут вне зависимости от температуры тела и клинических проявлений. Распространено неверное мнение, что для обнаружения малярийных паразитов кровь у больного следует брать на высоте приступа.

3. Для прокола кожи пальца используют стерильные одноразовые скарификаторы или специальные стерильные разового использования иглы.

4. Перед проколом кожу пальца тщательно протирают ватным тампоном, смоченным в 70 %-м спирте, чем достигается не только предупреждение инфицирования места прокола, но и попадание с кожи пальца бактерий, различных посторонних частиц на препарат крови, которые могут затруднить диагностику при микроскопии.

5. Первую каплю крови, выступившую после прокола, вытирают сухим стерильным ватным тампоном, чтобы и збежать фиксации эритроцитов остатками спирта, которым дезинфицировали кожу.

6. Последующие капли (выступающие самостоятельно или при легком надавливании на палеи массирующими движениями) используются для приготовления препаратов крови. Кровь набирают в стерильный сухой гематологический капилляр, из которого быстро переносят на предметное стекло, либо выступившую кровь непосредственно из прокола пальца наносят на предметные стекла.

7. От одного пациента готовят не менее 3 стекол с толстыми каплями и 3 тонких мазка крови. Рекомендуется первоначально окрасить по одному стеклу, чтобы иметь возможность исправить дефекты окраски.

4.4. Приготовление препаратов крови, их маркировка и фиксация

4.4.1. Препарат толстая катя

Препарат толстая капля готовится следующим образом:

— на предметное стекло наносят 2 капли крови диаметром около 5 мм, кровь распределяют в равномерные диски диаметром 1,0—1,5 см с помощью угла чистого стекла или в прямоугольники с помощью скарификатора, которым прокалывали кожу;

— между каплями делается мазок в виде полоски дзя маркировки препарата отдельного пациента, при массовых обследованиях делаются две полоски: на одной полоске указывается Ф.. И.. О. и дата взятия крови, на другой — название лечебно-профилактического учреждения (код), где проводилось обследование;

— на предметном стекле готовят мазок крови более толстый, чем требуемый для исследования на малярию;

— сразу после приготоатения мазка, пока он не высох, наносят кровь из капилляра или апажной поверхностью мазка прикасаются к выступившей капле крови;

— приготовленный препарат кладут на горизонтальную поверхность, капля крови распределяется по влажному мазку, величина капель зависит от количества крови и ее реологических свойств (вязкость).

Рис. I. Толстые капли на предметном стекле без мазка

Рис. 2. Толстые капли на мазке

Толщина толстой капли должна быть такой, чтобы через нее после высыхания просматривался газетный текст. Слишком толстая капля может оторваться от стекла при высушивании; такой препарат не пригоден для исследования. Маркировка препарата производится на мазке крови между каплями.

Толстая капля на мазке имеет преимущества, так как на мазке чаще сохраняются нс полностью гемолизированные эритроциты, что может помогать дифференциальному диагнозу, поскольку в мазке, несмотря на гемолиз, могут сохраняться азурофильные элементы в эритроцитах (зернистость Шюффнера, Джеймса и пятнистость Маурера). Капля крови, нанесенная на мазок, более прочно прикрепляется, чем нанесенная непосредственно на предметное стекло.

Независимо от методики приготовления показателем достаточного содержания крови в толстой капле является обнаружение в 1 поле зрения микроскопа в среднем 10—20 лейкоцитов (увеличение: объектив х90—хЮО. окуляр х7; х8; хЮ).

В особых условиях при дефиците стекол, особенно при массовых обследованиях, на предметном стекле одновременно готовят тонкий мазок и толстую каплю.

Рис. 3. Комбинированное приготовление препаратов крови

Этот метод, однако, требует ряда предосторожностей. Для того чтобы оба препарата были пригодны для исследования, необходимо начинать с окраски толстой капли погружением соответствующего участка предметного стекла в раствор краски. Затем фиксируют тонкий мазок и окрашивают его. Нельзя начинать с фиксации тонкого мазка, так как даже при очень аккуратном погружении в фиксирующую жидкость участка предметного стекла, на который нанесен тонкий

мазок, в толстой капле эритроциты могут подвергнуться фиксации парами фиксатора. При последующей окраске такая капля станет непригодной для исследования, даже если фиксация была неполной.

Высушивание толстых капель на солнце, огне или любом другом источнике тепла неконтролируемой температуры исключается, так как вследствие фиксации необходимый при окраске гемолиз не происходит и препарат становится непригодным для исследования.

Толстые капли (особенно в процессе высыхания) и фиксированные тонкие мазки следует беречь от тараканов, мух и муравьев.

4.4.2. Препарат тонкий липок

Препарат тонкий мазок делают так же, как для подсчета формулы крови.

1. На край предметного стекла, отступив 0.5—1.0 см. наносят небольшую каплю крови.

2. Предметное стекло с нанесенной каплей кладут на горизонтальную поверхность стола, при этом край стекла с каплей крови должен быть справа 1 .

3. Двумя пальцами левой 1 руки предметное стекло за боковые поверхности фиксируется на столе.

4. Край шлифованного стекла (фиксированного в правой 1 руке) ставится под углом 45 е к предметному стеклу, прикасаясь к левому 1 краю капли крови.

5. После того как капля растекается по линии касания в месте соприкосновения обоих стекол, шлифованное стекло быстрым движением продвигают справа налево 1 к противоположному краю предметного стекла, постепенно ослабляя давление на предметное стекло, что позволяет закончить тонкий мазок бахромчатой частью, где эритроциты располагаются в один слой свободно, не налегая друг на друга, где четко видны специфические особенности морфологии паразитов и изменения пораженных эритроцитов. Мазок крови должен быть тонким, равномерным, не доходить приблизительно на l/з стекла до конца и краев предметного стекла (рис. 4).

Если угол наклона шлифованного стекла увеличить, то мазок получится короткий и толстый, с расположением эритроцитов в несколько слоев (это может маскировать некоторых паразитов, а также приводить к их деформации), если уменьшить угол наклона, то трудно создать бахромчатую часть мазка.

Качество тонкого мазка зависит также от правильной подготовки предметного стекла и равномерности края шлифованного стекла.

На плохо вымытом, жирном стекле и при дефектах на краю шлифованного стекла тонкий мазок получается неравномерным и с просветами. Возможные дефекты тонких мазков показаны на рис. 5.

Рис. 5. Дефекты приготовления тонких мазков

4.4.3. Маркировка препаратов крови

1. Высохшие препараты крови маркируют простым карандашом (он не смывается во время фиксации и окрашивания) или маркером, устойчивым к спирту.

2. Маркировка включает фамилию и инициалы, номер истории болезни или порядковый номер по списку обследуемого, дату и время взятия крови.

3. Препарат толстая капля, приготовленный непосредственно на предметном стекле, маркируют на полоске крови.

4.4.4. Фиксация тонких мазков

1. Фиксацию мазков проводят путем погружения: этиловым спиртом 96 е — 10 мин либо смесью Никифорова — 20 мин, фиксатором-красителем по Май-Грюнвальду — 2—3 мин.

2. Мазки погружают и извлекают из фиксирующей жидкости пинцетом.

3. Препараты по окончании фиксации высушивают на воздухе.

4. Препарат толстая капля на подкладке маркируют по мазку, не задевая каплю.

5. Тонкий мазок маркируют в толстой части, не захватывая тонкую часть и края препарата (не следует делать надпись вдоль всего мазка).

Препарат толстая капля не фиксируют!

При длительном хранении неокрашенных толстых капель при массовых эпид-обслсдованиях в очагах (особенно в жарком климате) может произойти их фиксация. При необходимости хранения толстых капель для предотвращения фиксации препараты до окраски следует обработать забуференным раствором метиленового синего (1 г метиленового синего + 3 г Na₂HP0₄ + I г КН₂Р0₄ + 300 мл дистиллированной воды). Толстую каплю после высыхания погружают в этот раствор на 1 с, промывают водой и высушивают. В таком виде каплю можно хранить длительное время. Перед исследованием такую толстую каплю окрашивают по Романовскому-Гимзс меньшее время, чем обычно — в течение 6—10 мин.

4.5. Окраска препаратов крови

Одним из основных условий правильной паразитологической диагностики малярии является качественная окраска препаратов крови. Окраску препаратов крови на малярию рекомендуется проводить в вытяжном шкафу, так как в состав краски и фиксаторов входят летучие токсические вещества.

Для лаборанта-лсвши вместо левого положения — читать правое, вместо правого — левое.

источник