Хромосомный анализ лимфоцитов периферической крови

Кариотипирование является методом цитогенетического исследования и заключается в изучении хромосом человека.

В процессе исследования хромосомного набора (кариотип) определяются изменения в количественном составе и выявляются нарушения структур (качество) хромосом.

Кариотипирование проводится один раз в жизни и позволяет определить геном мужчины и женщины, состоящих в браке, выявить несоответствие хромосом супругов, что может явиться причиной рождения ребенка с пороком развития или тяжелым генетическим заболеванием, а также позволяет установить причину, по которой невозможно иметь детей у данной семейной пары.

Кариотип – это набор хромосом человека с полным описанием всех их признаков (размер, количество, форма и прочее). Геном каждого человека в норме состоит из 46 хромосом (23 пары). 44 хромосомы являются аутосомными и отвечают за передачу наследственных признаков в роду (цвет волос, строение ушей, острота зрения и так далее). Последняя, 23-я пара представлена половыми хромосомами, которые и определяют кариотип женщины 46ХХ и мужчины 46ХУ.

В идеале, кариотипирование необходимо пройти всем супругам, желающим стать родителями, даже если показания для проведения анализа отсутствуют.

Многие наследственные заболевания, которыми страдали прадедушки и прабабушки могут не проявляться у человека, а кариотипирование поможет выявить патологическую хромосому и рассчитать риск рождения ребенка с патологией.

К обязательным показаниям для проведения процедуры относятся:

возраст будущих родителей (35 лет и старше, даже если этому пункту отвечает только один из супругов);
бесплодие неустановленного происхождения;
многократные и безуспешные попытки искусственного оплодотворения (ЭКО);
наличие наследственного заболевания у одного из супругов;
расстройства гормонального баланса у женщины;
нарушение образования сперматозоидов (сперматогенеза) с неустановленной причиной;
неблагоприятное экологическое окружение;
контакт с химическими веществами и облучающее воздействие;
воздействие вредных факторов на женщину, особенно в недавнем прошлом: курение, алкоголь, наркотики, прием лекарственных препаратов;
наличие самопроизвольного прерывания беременности (выкидыши, преждевременные роды, замершие беременности);
близкородственные браки;
наличие ребенка/детей с хромосомными патологиями или врожденными пороками развития.

Процедуру исследования кариотипов супругов необходимо провести еще на этапе планирования беременности. Но не исключается возможность кариотипирования в том случае, если женщина беременна. Тогда проводится кариотипирование не только супругов, но и будущего ребенка (пренатальное кариотипирование).

Так как для анализа на определение кариотипа используются кровяные клетки, необходимо исключить влияние различных факторов, которые осложняют их рост, что делает анализ неинформативным.

Примерно за 2 недели до сдачи крови на анализ кариотипирования следует предотвратить или отказаться от воздействия следующих факторов:

наличие острых заболеваний или обострение хронических;
прием лекарственных препаратов, особенно антибиотиков;
употребление алкоголя и курение.

Предпочтение отдается венозной крови, которую забирают у обоих супругов. Из венозной крови отсеиваются лимфоциты, которые находятся в фазе митоза (деления). В течение трех суток анализируется рост и размножение клеток, для чего лимфоциты обрабатывают митогеном, который стимулирует митоз. В процессе деления исследователь может наблюдать хромосомы, но процесс митоза останавливают путем специальной обработки. Затем готовятся специальные препараты хромосом на стекле.

Чтобы лучше выявить структуру хромосом, их окрашивают. Каждая хромосома имеет свою индивидуальную исчерченность, что становится хорошо заметным после окрашивания. Затем проводится анализ окрашенных мазков, во время которого определяется общее количество хромосом и структура каждой. При этом сопоставляется исчерченность парных хромосом, а полученный результат с нормами цитогенетических схем хромосом.

Для анализа обычно требуется не более 12-15 лимфоцитов, данное количество клеток позволяет выявить количественное и качественное несоответствие хромосом, а, следовательно, наследственное заболевание.

Интерпретацию анализа на кариотипирование проводит врач-генетик. Анализ в норме выглядит как 46ХХ или 46ХУ. Но если выявлена какая-либо генетическая патология, например выявление третьей лишней 21 хромосомы у женщины, то результат будет выглядеть как 46ХХ21+.

Что позволяет определить анализ хромосомного набора:

трисомия – третья лишняя хромосома в паре (например, синдром Дауна);
моносомия – в паре отсутствует одна хромосома;
делеция – утрата участка хромосомы;
дупликация – удвоение какого-либо фрагмента хромосомы;
инверсия – разворот участка хромосомы;
транслокация – перемещение участков (рокировка) хромосомы.

Например, обнаружение делеции в У-хромосоме часто является причиной нарушенного сперматогенеза и, следовательно, мужского бесплодия. Также известно, что делеции являются причиной некоторых врожденных патологий у плода.

Для удобства отображения на бумаге результата анализа при обнаружении изменения структуры хромосомы, длинное плечо записывается латинской буквой q, а короткое t. Например, при потере фрагмента короткого плеча 5-ой хромосомы у женщины, результат анализа будет выглядеть так: 46ХХ5t, что означает синдром «кошачьего крика» (генетическое отклонение, характеризующееся характерным плачем ребенка и другими врожденными нарушениями).

Кроме того, кариотипирование позволяет оценить состояние генов. Путем данного метода исследования можно выявить:

генные мутации, которые влияют на тромбообразование, что нарушает кровоток мелких сосудах при формировании плаценты или имплантации и может стать причиной выкидыша/бесплодия;
генная мутация У-хромосомы (в данном случае необходимо использовать сперму донора);
мутации генов, отвечающих за детоксикацию (низкая способность организма к обеззараживанию окружающих токсических факторов);
генная мутация в гене муковисцидоза помогает исключить возможность данного заболевания у ребенка.

Кроме того, кариотипирование помогает диагностировать генетическую предрасположенность ко многим заболеваниям, например, к инфаркту миокарда, сахарному диабету, гипертонической болезни, патологии суставов и пр.

В случае обнаружения генных мутаций или хромосомных аберраций у одного из супругов на этапе планирования беременности, врач-генетик объясняет паре вероятность рождения больного ребенка и возможные риски.

Как известно, хромосомная и генная патология неизлечима, поэтому дальнейшее решение ложится на плечи будущих родителей (воспользоваться донорской спермой или яйцеклеткой, рискнуть родить ребенка или остаться без детей).

При обнаружении хромосомных аномалий во время беременности, особенно у эмбриона, женщине предлагают ее прервать. Настаивать на прерывании беременности врачи не имеют права.

При некоторых хромосомных аномалиях (например, риск рождения ребенка с патологией не высокий) генетик может назначить курс определенных витаминов, которые снижают вероятность рождения больного ребенка.

источник

Исследование кариотипа (количественные и структурные аномалии хромосом) по лимфоцитам периферической крови (1 человек)

Цитогенетическое исследование – кариотипирование – является основным методом диагностики хромосомных нарушений и проводится в целях выявления нарушений количества и структуры хромосом. Используется для пренатальной диагностики.

Хромосомные риски
Кариотипирование супругов
Определение хромосомного набора

Karyotyping
Karyotyping Chromosome Analysis

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование проводится в состоянии сытости, не рекомендуется сдавать кровь на данное исследование натощак.
Исключить (по согласованию с врачом) прием антибактериальных и химиотерапевтических препаратов в течение 14 дней до исследования.
Исследование рекомендуется проводить не ранее чем через 2 недели после перенесенных инфекционных/острых воспалительных заболеваний.

Общая информация об исследовании

Кариотипирование – цитогенетическое исследование, изучение хромосомного набора человека, позволяющее обнаружить отклонения в структуре и числе хромосом. Оно помогает выявить нарушения хромосом, вероятно, не влияющие на здоровье человека, но тем не менее важные для планирования будущей беременности и для здоровья будущего ребенка (патологии плода, аномалии развития).

Кариотип – это полный хромосомный набор клетки человека. В норме он состоит из 46 хромосом, из них 44 аутосомы (22 пары), имеющих одинаковое строение и в мужском, и в женском организме, и одна пара половых хромосом (XY у мужчин и XX у женщин). Каждая хромосома несет гены, ответственные за наследственность. Кариотип 46, ХХ – соответствует нормальному женскому кариотипу, а кариотип 46, XY – это нормальный мужской кариотип. Кариотип остается неизменным в течение всей жизни.

Нарушения хромосомного набора могут являться причиной наследственной патологии, бесплодия, невынашивания беременности, рождения ребенка с различными пороками развития.

Для цитогенетического исследования хромосом чаще всего используют препараты кратковременной культуры крови, реже клетки костного мозга и культуры фибробластов.

Кариотипирование культуры лимфоцитов периферической крови человека – сложное многоступенчатое цитогенетическое исследование, проводится, когда клетки входят в фазу митоза – непрямого деления с тождественным распределением генетического материала между дочерними клетками. Оно включает в себя следующие этапы:

Постановка культуры лимфоцитов, рост клеток в течение 72 часов. (Рост клеток может быть осложнен различными факторами: наличие инфекционных, хронических, простудных заболеваний; прием лекарственных препаратов; диета; прием алкоголя и т. п. Все эти факторы необходимо исключить перед сдачей анализов).
Обработка культур лимфоцитов: колхицинизация, гипотонизация, фиксация.
Приготовление препаратов хромосом на стекле.
Монохромное и дифференциальное окрашивание препарата.
Анализ препаратов (подсчитывается общее количество хромосом, проводится оценка структуры каждой хромосомы). Анализ хромосом осуществляется на разрешении в 400-500 полос (бэндов).

Различают несколько видов нарушений структуры хромосом:

трисомии – добавление еще одной хромосомы к паре;
моносомии – утрата одной хромосомы из пары;
делеции – утрата участка хромосомы;
дупликации – повторение определенного участка хромосомы;
инверсии – поворот участка хромосомы на 180 градусов;
транслокации – перенос участков хромосомы в новое положение.

Хромосомные нарушенияразличаются также по принципу регулярности. Регулярные мутации присутствуют при делении каждой клетки или большинства клеток. Они проявляются в момент зачатия плода либо в первые несколько дней беременности. Нерегулярные аберрации появляются в результате негативного воздействия радиации, химических средств и т.д.

Нарушение расхождения хромосом может произойти во время клеточного деления (мейоза). Если такое нарушение происходит в процессе образования сперматозоидов или яйцеклеток, то в половой клетке появляется лишняя хромосома, которая при зачатии будет передана ребенку. В результате она будет присутствовать во всех клетках организма ребенка. Примером трисомии может служить синдром Дауна (лишняя 21-я хромосома) или синдром Патау (трисомия 13-й хромосомы). Также нарушение расхождения хромосом может произойти при первых делениях оплодотворенной яйцеклетки. Например, утрата Х-хромосомы приводит к развитию Х0-синдрома, или синдрома Шерешевского – Тернера. Аномалии, связанные с нарушением расхождения хромосом, встречаются не так часто, поэтому вероятность их повторения в одной и той же семье достаточно мала.

Структурные же нарушения хромосом передаются по наследству, при этом степень семейного риска и дальнейшая передача дефекта от поколения к поколению становится значительно высокой.

Кариотипирование также рекомендуют проводить в тех семьях, где есть высокая вероятность рождения ребенка с болезнью, сцепленной с Х-хромосомой.

Когда назначается исследование?

Показания для кариотипирования супружеских пар:

мужское бесплодие: тяжелая олигозооспермия, необструктивная азооспермия, тератозооспермия;
первичная аменорея;
привычное невынашивание беременности в первом триместре (2 и более выкидышей);
наличие выкидышей неясного генеза в анамнезе;
случаи мертворождений в анамнезе;
случаи ранней младенческой смертности в анамнезе;
рождение детей с хромосомной аномалией (например, синдромом Дауна);
рождение детей с множественными врождёнными пороками развития (МВПР);
планирование ЭКО;
неудачные попытки ЭКО;
прогноз здоровья будущего ребенка.

Показания для кариотипирования детей:

наличие врождённых пороков развития;
умственная отсталость;
задержка психомоторного развития;
задержка психо-речевого развития в сочетании с микроаномалиями;
нарушение или задержка полового развития;
задержка роста;
аномалии пола.

Для мужчин нормальным считается кариотип 46,XY. Это означает, что определено 46 нормальных хромосом, в том числе X и Y хромосома.

Для женщин нормальным считается кариотип 46,XX. Это означает, что определено 46 нормальных хромосом, в том числе две X хромосомы.

В случае выявления патологического кариотипа, необходима консультация медицинского генетика по результатам исследования для правильной его интерпретации.

Reddy UM, Page GP, Saade GR, et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth. N Engl J Med 2012;367:2185-93.
Murphy KM, Cohen JS, Goodrich A, Long PP, Griffin. CA 2007. Constitutional duplication of a region of chromosome Yp encoding AMELY, PRKY, and TBL1Y: implications for chromosome analysis. J Mol Diagn, 9: 408-413.
ISCN (2013): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature; Karger AG, Basel, 2013/
ISCN (2016): An International System for Human Cytogenetic Nomenclature; S. Karger AG, Basel, 2016/
ISCN Symbols and Abbreviated Terms//Coriell Institute for Medical Research/

источник

Исследование кариотипа (количественные и структурные аномалии хромосом) по лимфоцитам периферической крови (1 человек)

Хромосомные риски
Кариотипирование супругов
Определение хромосомного набора

DNA Test
Karyotyping
Karyotyping Chromosome Analysis

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Как правильно подготовиться к исследованию?

Исследование проводится в состоянии сытости, не рекомендуется сдавать кровь на данное исследование натощак.
Исключить прием антибактериальных препаратов в течение 1 месяца до исследования.

Общая информация об исследовании

Хромосомные аберрации (отклонения от нормы), нарушая баланс наследственных факторов, являются причиной многообразных отклонений в строении и функциях организма, проявляющихся в так называемых хромосомных болезнях. Около 170 из 1000 эмбрионов погибают до рождения, в 40% причиной являются хромосомные нарушения.

Постановка культуры лимфоцитов, рост клеток в течение 72 часов. (Рост клеток может быть осложнен различными факторами: наличие инфекционных, хронических, простудных заболеваний; прием лекарственных препаратов; диета; прием алкоголя и т. п. Все эти факторы необходимо исключить перед сдачей анализов).
Обработка культур лимфоцитов: колхицинизация, гипотонизация, фиксация.
Приготовление препаратов хромосом на стекле.
Монохромное и дифференциальное окрашивание препарата.
Анализ препаратов (подсчитывается общее количество хромосом, проводится оценка структуры каждой хромосомы). Анализ хромосом осуществляется на высоком разрешении в 600-850 полос (бэндов) под 1000-кратным увеличением.

Различают несколько видов нарушений структуры хромосом:

трисомии – добавление еще одной хромосомы к паре;
моносомии – утрата одной хромосомы из пары;
делеции – утрата участка хромосомы;
дупликации – повторение определенного участка хромосомы;
инверсии – поворот участка хромосомы на 180 градусов;
транслокации – перенос участков хромосомы в новое положение.

Хромосомные аберрации различаются также по принципу регулярности. Регулярные мутации присутствуют при делении каждой клетки или большинства клеток. Они проявляются в момент зачатия плода либо в первые несколько дней беременности. Нерегулярные аберрации появляются в результате негативного воздействия радиации, химических средств и т.д.

Кариотипирование рекомендуют проводить в тех семьях, где есть высокая вероятность рождения ребенка с болезнью, сцепленной с Х-хромосомой. Например, дальтонизм – многие гены, участвующие в процессе цветовосприятия, находятся на Х-хромосоме, что является причиной возникновения дальтонизма у мужчин, а не у женщин, поскольку Х-хромосома у мужчин одна. Следовательно, если женщина носительница гена заболевания, то вероятность данного заболевания у ее сыновей равна 50%. Дочери этой женщины сами будут здоровы, но с вероятностью 50% будут носительницами дефектного гена.

Когда назначается исследование?

Показания для кариотипирования супружеских пар:

мужское бесплодие: тяжелая олигозооспермия, необструктивная азооспермия, тератозооспермия;
первичная аменорея;
привычное невынашивание беременности в первом триместре (2 и более выкидышей);
наличие выкидышей неясного генеза в анамнезе;
случаи мертворождений в анамнезе;
случаи ранней младенческой смертности в анамнезе;
рождение детей с хромосомной аномалией (например, синдромом Дауна);
рождение детей с множественными врожденными пороками развития (МВПР);
планирование ЭКО;
неудачные попытки ЭКО;
прогноз здоровья будущего ребенка.

Показания для кариотипирования детей:

наличие врожденных пороков развития;
умственная отсталость;
задержка психомоторного развития;
задержка психо-речевого развития в сочетании с микроаномалиями;
нарушение или задержка полового развития;
задержка роста;
аномалии пола.

В соответствии с выявленными нарушениями (или их отсутствием) составляется заключение, включающее оценку генетического риска.

Reddy UM, Page GP, Saade GR, et al. Karyotype versus microarray testing for genetic abnormalities after stillbirth. N Engl J Med 2012;367:2185-93.
Murphy KM, Cohen JS, Goodrich A, Long PP, Griffin. CA 2007. Constitutional duplication of a region of chromosome Yp encoding AMELY, PRKY, and TBL1Y: implications for chromosome analysis. J Mol Diagn, 9: 408-413.

Оставьте ваш E-mail и получайте новости, а также эксклюзивные предложения от лаборатории KDLmed

источник

Биологическая дозиметрия на основе цитогенетического анализа

ФГУ «Российский научный центр рентгенорадиологии» Минздравсоцразвития РФ», г. Москва.

Адрес документа для ссылки : h ttp://vestnik.rncrr.ru/vestnik/v11/papers/ snigir 2_ v 11. htm

Статья опубликована 7 февраля 2011 года.

Идентификационный номер статьи в ФГУП НТЦ “ИНФОРМРЕГИСТР”:

Рабочий адрес: 117997, ГСП-7, Москва, ул. Профсоюзная, д. 86, ФГУ «РНЦРР»

Снигирева Галина Петровна : д.б.н. руководитель лаборатории молекулярной биологии отдела патоморфологии и лабораторной диагностики ФГУ «РНЦРР» Минздравсоцразвития РФ, раб.тел.:+7(495) 334-92-88, e — mail sni_gal@mail.ru

В обзоре представлено описание двух наиболее значимых цитогенетических методов индикации и дозиметрии ионизирующего излучения. Показаны их возможности и ограничения при обследовании людей, подвергшихся радиационному воздействию при различных аварийных и чрезвычайных ситуациях.

Ключевые слова: ионизирующее излучение, биологическая дозиметрия, хромосомные аберрации, FISH метод.

Biological dosimetry on the strength of cytogenetic analysis.

Federal State Establishment Russian Scientific Center of Roentgenoradiology (RSCRR) of Ministry of Health and Social Development of Russian Federation , Moscow

The review presents descriptions of the two most significant cytogenetic methods for indication and dosimetry of ionizing irradiation. Possibilities and limitations of these methods considered are shown in reference to examination of people exposed to radiation owing to different emergency and extraordinary situations.

Key words : ionizing irradiation, biological dosimetry, chromosome aberrations, FISH method

Цитогенетические методы в радиационных исследованиях

Человеку приходится сталкиваться с источниками ионизирующего излучения при самых разных обстоятельствах. Наряду с медицинским облучением населения в диагностических и терапевтических целях, использование радиоактивных источников в различных областях науки, промышленности и медицины не исключает возможности профессионального облучения специалистов. В условиях постоянного повышенного радиационного фона работают космонавты, которые совершают длительные полеты на околоземной орбите.

Применение ядерных технологий с использованием источников ионизирующего излучения в военных и мирных целях могут создавать опасность радиационных аварий, когда в результате радиоактивного загрязнения местности облучению могут подвергаться многочисленные группы людей, а внештатные ситуации на предприятиях атомного комплекса могут приводить к переоблучению персонала. Примерами таких ситуаций являются аварии на ядерном реакторе в Селлафилде в Англии в 1957 г ., на производственном объединении «Маяк» на Урале в 1957 г ., на атомной станции Три Майл Айленд в США в 1979 г . и Чернобыльской атомной станции в 1986 г .

Для того, чтобы предсказать тяжесть радиационного поражения организма, вовремя оказать эффективную помощь, а также оценить возможные последствия облучения, необходимо иметь достоверную информацию о полученной дозе ионизирующего излучения. При радиационных авариях и в других случаях неконтролируемого облучения данные физической дозиметрии часто бывают ограничены, нуждаются в уточнении или могут полностью отсутствовать. Подобные ситуации имели место при облучении населения в результате ядерных взрывов на Семипалатинском полигоне, сброса радиоактивных отходов в р. Теча в Челябинской области, аварии на Чернобыльской АЭС. В таких случаях особое значение приобретают биологические маркеры радиационного воздействия.

На протяжении нескольких десятков лет проводились исследования, направленные на поиск чувствительных биологических маркеров, специфичных для радиационного воздействия и информативных как в раннем, так и отдаленном периоде после облучения. [7]. В результате были сформулированы принципы биологической индикации и требования, предъявляемые к биологическим маркерам, основными из которых являются специфичность, т.е. способность реагировать на облучение существенно сильнее, чем на любое другое воздействие нерадиационной природы, и количественная зависимость от дозы радиационного воздействия.

В настоящее время одними из немногих биологических показателей (наряду с ЭПР-спектроскопией эмали зубов), в полной мере отвечающих этим требованиям, являются хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови [3, 33,64].

Принципы цитогенетического метода индикации радиационного воздействия достаточно убедительно обоснованы во многих отечественных и зарубежных исследованиях, результаты которых послужили основой для выработки рекомендаций ВОЗ, МАГАТЭ и НКДАР ООН по практическому использованию анализа хромосомных аберраций в лимфоцитах крови в качестве тест-системы для количественной оценки действия мутагенных факторов радиационной природы [46, 47, 89, 93]. Информация о «биологической» дозе, полученная с помощью цитогенетических методов, шире, чем ее физическое значение, т.к. она отражает не только результат радиационного воздействия на организм человека, но и его индивидуальную радиочувствительность, что позволяет более корректно прогнозировать ранние и отдаленные последствия облучения.

Анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови нашел широкое применение при молекулярно-эпидемиологическом обследовании людей, подвергшихся облучению [35, 37, 38].

Известно, что повреждение генетического аппарата клетки, которое может проявляться на уровне структурных перестроек хромосом в виде симметричных транслокаций, в ряде случаев лежит в основе радиационного канцерогенеза [73]. Повышенный уровень хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови может предшествовать развитию патологических процессов или просто быть индикатором неблагополучия в организме человека.

В настоящее время в большинстве случаев, при которых люди подвергаются воздействию радиации, как от естественных, так и от техногенных источников, речь идет об облучении в небольших дозах. Поэтому главную озабоченность вызывают последствия радиационного воздействия в малых дозах, особенности биологических эффектов которых до сих пор являются предметом активных дискуссий [1, 20, 22, 61 и др.].

Радиационное воздействие на организм человека приводит к нарушению нормального состояния и функционирования клеточного генома. Ведущая роль в развитии лучевых повреждений принадлежит молекулам ДНК, повреждения которых могут привести к гибели клетки, нарушениям структуры хромосом, проявляющимся в виде хромосомных аберраций, или каким-либо другим мутационным событиям, которые впоследствии могут стать причиной развития радиационно-индуцированного рака и наследственных заболеваний. Анализ уровня хромосомных повреждений в лимфоцитах периферической крови лежит в основе цитогенетического метода, с помощью которого возможно проводить биологическую индикацию и дозиметрию радиационного воздействия.

Цитогенетические исследования стали широко использоваться еще в первой половине ХХ века для изучения морфологии хромосом человека. Развитие современной цитогенетики человека связано с именами известных цитологов Д. Тио и А. Левана, которые в 1956 г . первыми определили, что у человека 46 хромосом. Интенсивные исследования привели к тому, что в 1959 г . французскими учеными (Д. Лежен, Р. Тюрпен и М. Готье) была установлена хромосомная природа болезни Дауна. Начиная с 1960 г . цитогенетика становится важнейшим разделом практической медицины. Была разработана первая Международная классификация хромосом (г. Денвер, 1960 г .), предложен метод получения метафазных хромосом из лимфоцитов периферической крови, культивируемых с фитогемагглютинином [60], который стал основой стандартного цитогенетического метода. Этот метод нашел широкое применение не только для диагностики хромосомных болезней, но и при проведении исследований, связанных с изучением воздействия на организм человека различных мутагенных факторов окружающей среды, среди которых наиболее значимым является радиация. В 1974 году Всемирная Организация Здравоохранения рекомендовала анализ хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови в качестве чувствительного метода, позволяющего определять мутагенные эффекты воздействия неблагоприятных факторов окружающей среды на организм человека [93]. В нашей стране цитогенетические исследования в этой области получили развитие благодаря работам Л.Г. Дубининой, Н. П. Бочкова, А.В. Севанькаева, В. А. Шевченко, И.Е. Воробцовой и других известных цитогенетиков.

Чаще всего при изучении радиационного воздействия на организм человека используют культуру лимфоцитов периферической крови. Лимфоциты периферической крови представляет собой достаточно простую и в тоже время уникальную по своим возможностям модель для изучения радиационного мутагенеза. Необходимо подчеркнуть высокую радиочувствительность лимфоцитов, позволяющую регистрировать повышенный уровень хромосомных аберраций даже при воздействии в небольших дозах. Для получения культуры лимфоцитов достаточно взять всего несколько миллилитров венозной крови и поместить в питательную среду, содержащую стимулятор роста – фитогемагглютинин (ФГА). Следует заметить, что в норме лимфоциты периферической крови, как правило, не делятся (только около 1 % клеток находится в процессе деления), находясь в стадии покоя (стадия G клеточного цикла) и представляя естественно синхронизированную популяцию клеток. Под действием ФГА лимфоциты претерпевают бласттрансформацию с последующим вступлением в митоз, что и дает возможность проводить анализ хромосом, используя световую микроскопию. Мобильность лимфоцитов в кровяном русле, их распределение практически по всему телу, а также способность лимфоцитов аккумулировать хромосомные аберрации позволяют судить о радиационном воздействии на организм человека в целом.

В настоящее время два цитогенетических метода, основанных на анализе частоты нестабильных (дицентриков и центрических колец) и стабильных хромосомных аберраций (симметричных транслокаций), используют для биологической индикации и дозиметрии ионизирующего излучения.

Классический цитогенетический метод – анализ нестабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови

Одним из наиболее востребованных и хорошо изученных цитогенетических методов, применяемых для биологической индикации и дозиметрии ионизирующего излучения, является классический (синонимы: рутинный или стандартный) метод — анализ хромосомных аберраций на метафазных препаратах, предварительно окрашенных красителем Гимза. Как правило, при проведении такого анализа регистрируют хромосомные аберрации, не требующие специальных методов обработки цитогенетических препаратов для их идентификации, и которые можно легко анализировать с помощью обычного светового микроскопа.

Наибольший интерес среди наблюдаемых с помощью классического цитогенетического метода повреждений хромосом представляют дицентрики и центрические кольца. По частоте дицентриков и центрических колец устанавливают факт облучения, оценивают уровень радиационного воздействия, определяют величину полученной дозы ионизирующего излучения.

Низкий спонтанный уровень дицентриков и центрических колец, а также зависимость выхода частоты хромосомных аберраций от дозы ионизирующего излучения позволяют использовать классический цитогенетический метод для количественной индикации радиационного воздействия. Нижний предел чувствительности метода зависит от количества проанализированных клеток, в среднем составляя 100 мГр для рентгеновского и гамма-излучения и около 50 мГр для быстрых нейтронов [29]. Некоторые исследователи приводят и более низкие значения [64].

В экспериментальных исследованиях на животных [28], а также при цитогенетических обследованиях пациентов, проходивших курс лучевой терапии [39, 79], было показано, что частота дицентриков и центрических колец в лимфоцитах периферической крови сопоставима при облучении in vivo и in vitro . Этот факт является главной предпосылкой для использования калибровочных кривых «доза-эффект», полученных in vitro , в исследованиях по биологической дозиметрии. Характер кривой «доза-эффект» для частоты дицентриков и центрических колец зависит от вида ионизирующего излучения и его энергетических характеристик [53].

Классический цитогенетический метод не является универсальным и ограничен определенным временным периодом исследования после радиационного воздействия. Успешное применение анализа дицентриков и центрических колец для определения дозы облучения возможно, в основном, вскоре после острого однократного относительно равномерного радиационного воздействия в ранние сроки (до 3 – 4 месяцев) [13, 36]. Это связано с тем, что со временем после облучения количество клеток с дицентриками постепенно уменьшается [30, 40]. Являясь генетически несбалансированными, клетки с дицентриками могут погибнуть в процессе клеточной пролиферации в результате образования мостов в анафазе при расхождении одних и тех же хроматид к разным полюсам веретена деления. Поэтому такие клетки получили название «нестабильные клетки» или «клетки с нестабильными хромосомными аберрациями».

Анализ динамики снижения уровня клеток с нестабильными аберрациями хромосом был предметом многих исследований, так как понимание закономерностей элиминации клеток необходимо не только для выяснения механизмов, лежащих в основе этого процесса, но и для корректной оценки дозы облучения спустя определенное время после радиационного воздействия. Данные, накопленные при цитогенетическом обследовании больных, проходивших курс лучевой терапии [40, 49], а также людей, пострадавших в результате аварий на предприятиях атомной промышленности [9, 50, 70, 78], позволили получить количественное описание процессов элиминации клеток с нестабильными хромосомными аберрациями. Представленные исследователями результаты далеко не однозначны. Параметры, описывающие кинетику элиминации лимфоцитов, значительно варьируют в зависимости от дозы ионизирующего излучения, индивидуальной радиочувствительности донора, условий облучения, а также действия различных дополнительных мутагенных факторов нерадиационной природы. Анализ имеющихся данных позволяет заключить, что элиминация клеток с нестабильными хромосомными аберрациями характеризуется фазами быстрого и медленного снижения, причем период полувыведения таких клеток из периферической крови может варьирвать от 110 дней до 4 лет [30, 33, 46, 69]. Неопределенность в оценке обусловлена, в первую очередь, условиями облучения (величина и мощность дозы, длительность и равномерность воздействия), а также существованием фракций лимфоцитов с разной радиочувствительностью и продолжительностью жизни, которая может варьировать от 15 дней до 6 лет [21, 34]. Предполагают, что наблюдаемое быстрое снижение частоты клеток с хромосомными аберрациями нестабильного типа сразу после облучения происходит за счет лимфоцитов с коротким периодом жизни [34]. В то же время описана фракция долгоживущих клеток, составляющая около 60% лимфоцитов циркулирующей крови, которые впервые могут вступать в деление спустя значительное время (годы) после радиационного воздействия [21]. Такие клетки способны сохранять хромосомные повреждения нестабильного типа на протяжении десятков лет.

Так как клетки с нестабильными хромосомными аберрациями со временем после облучения постепенно элиминируют из циркулирующей крови, то ретроспективная дозиметрия по частоте дицентриков при радиационном воздействии в низких дозах (до 0,5 Гр) представляется маловероятной. При облучении в более высоких дозах, с учетом параметров элиминации нестабильных клеток из периферической крови, можно оценить только средние дозы на группу. Индивидуальная дозиметрия если и возможна, то только с высокой степенью неопределенности [14].

При аварийных и чрезвычайных ситуациях в основном приходится сталкиваться с неравномерным или парциальным облучением организма. Значительные размеры тела человека и отдельных органов, их физиологические особенности могут приводить к существенному перепаду поглощенных доз в зависимости от расположения по отношению к источнику ионизирующего излучения, энергии и вида излучения. Следствием этого могут быть разные значения локальных доз, которые приводят к неодинаковому облучению лимфоцитов в различных частях облученного организма. Ситуация еще более усложняется тем, что в каждый определенный момент времени (приблизительно в течение 20-30 минут) только 3-5% лимфоцитов от общего числа присутствуют в периферической крови. Большая часть лимфоцитов находится в лимфатических тканях или других органах и может рециркулировать в периферическую кровь. При локальном облучении, особенно в больших дозах, специфические реакции клеток (снижение бластотрансформации, задержка клеточного деления, интерфазная гибель клеток) затрагивают только ту часть популяции лимфоцитов, которая более всего подвергается радиационному воздействию. Такая селекция лимфоцитов может привести к неправильной, с точки зрения биологической дозиметрии, интерпретации данных цитогенетического анализа. Наглядным примером является описанный в работе [29] случай переоблучения пациента (область ног) при гамма-радиографии. По частоте клеток с дицентриками была рассчитана доза, равная 250 мГр. Однако, клинические симптомы, а именно, прогрессирующая эритема, возникшая через 2 недели после облучения, позволила установить, что полученная пострадавшим доза локального облучения составляет 15 Гр. В данном случае частота дицентриков отражает дозу, усредненную по всему телу, и поэтому является малоинформативной.

Существенные трудности представляет интерпретация уровня хромосомных аберраций нестабильного типа при хроническом и пролонгированном облучении. Как известно, наблюдаемый при этом уровень хромосомных аберраций является результатом нескольких независимых процессов: образования хромосомных повреждений под действием радиации, элиминации клеток с нестабильными хромосомными аберрациями при прохождении клеточного цикла и репарации индуцированных радиацией повреждений. Воспроизвести эти процессы в эксперименте, при облучении лимфоцитов in vitro , естественно, невозможно. Анализ данных цитогенетического обследования различных групп людей, подвергавшихся длительному облучению вследствие аварийных ситуаций и в процессе профессиональной деятельности, показал, что в большинстве случаев наблюдается повышенный уровень хромосомных аберраций нестабильного типа [6, 8. 41, 77]. При этом отмечается высокая индивидуальная вариабельность частоты клеток с нестабильными хромосомными аберрациями. В случае статистически значимых различий со спонтанным уровнем, корреляции с дозой уровня хромосомных повреждений чаще всего не наблюдается, либо она может носить не линейный, а более сложный, характер. Поэтому при хроническом или пролонгированном облучении по частоте нестабильных хромосомных аберраций оценить полученные дозы чаще всего не представляется возможным. В данном случае результаты анализа нестабильных хромосомных аберраций позволяют только констатировать факт облучения.

Вместе с тем, несмотря на ограничения, классический цитогенетический метод до настоящего времени остается основным при проведении цитогенетического мониторинга облученных людей (44). Многие лаборатории мира применяют его при обследовании людей, облученных в результате чрезвычайных и аварийных ситуаций [5, 9, 11, 14, 24, 25, 49, 54, 67]. Результаты такого анализа позволяют существенно дополнить наши представления о механизмах радиационного мутагенеза, а также помогают целенаправленно и своевременно проводить необходимые профилактические и лечебные мероприятия для устранения возможных негативных последствий облучения.

FISH метод — анализ стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах крови

Под воздействием радиации в клетках, наряду с нестабильными хромосомными аберрациями – дицентриками, центрическими кольцами и ацентрическими фрагментами, образуются и так называемые стабильные хромосомные аберрации – симметричные транслокации, инсерции и инверсии, частота которых практически не меняется в течение длительного времени после облучения (месяцы, годы) и сохраняется примерно на одном уровне при повторных обследованиях. Это связано с тем, что стабильные хромосомные аберрации не подвергаются селекции во время клеточной пролиферации и легко преодолевают барьер клеточного деления. В ряде работ [25, 31, 40, 56, 75] данные, полученные при обследовании пациентов, проходящих курс лучевой терапии, а также пострадавших в результате атомной бомбардировки в Хиросиме, подтверждают этот факт. Так, цитогенетическое обследование пострадавших жителей Японии показало, что частота симметричных транслокаций, составляющая около 90-95 % от общего числа хромосомных аберраций, не меняется на протяжении нескольких десятилетий и коррелирует с дозой облучения [27]. Аналогичные результаты, свидетельствующие о длительном сохранении клеток со стабильными хромосомными аберрациями, были получены и многими другими исследователями, что позволило вполне обоснованно применять анализ транслокаций для ретроспективной оценки доз ионизирующего излучения.

Частота возникновения аберраций стабильного (транслокаций) и нестабильного (дицентриков и центрических колец) типов после облучения приблизительно одинаковая [39, 40, 86]. До недавнего времени для анализа частоты транслокаций применяли классический цитогенетический метод или метод G-дифференциального окрашивания. В первом случае анализ частоты транслокаций не эффективен, т.к. позволяет выявлять не более 20 % стабильных хромосомных аберраций [62], а во втором — требует значительного времени и хорошо подготовленных специалистов, несмотря на имеющиеся в настоящее время системы для автоматического кариотипирования. При кариотипировании хромосом после G-дифференциального окрашивания анализируется каждая хромосома, т.е. 100% генома, что, естественно, делает этот метод в высшей степени информативным, хотя и есть некоторые ограничения в разрешающей способности, особенно при анализе концевых участков хромосом [10]. Высокие квалификационные требования к специалистам, трудоемкость и сложность анализа, к сожалению, не позволяют анализировать достаточное для получения статистически достоверных данных количество метафаз.

В конце прошлого столетия появилась возможность анализировать частоту симметричных транслокаций и других хромосомных перестроек с помощью флуоресцентного метода окрашивания после гибридизации in situ метафазных препаратов со специфичными к определенным последовательностям ДНК зондами (FISH метод). В 1986 году Pinkel и соавт. [66] впервые продемонстрировали возможности FISH метода для анализа симметричных транслокаций. Несколько позже этот метод был применен [55] для анализа индуцированных радиацией хромосомных аберраций. Как правило, для проведения анализа выбирают две-три пары хромосом достаточно большого размера, которые составляют около 10-20 % генома. Оценив частоту транслокаций, в образовании которых участвуют окрашенные с помощью ДНК проб хромосомы, можно определить общую для всего генома частоту транслокаций, используя специальную формулу для пересчета [56], которая предполагает равновероятное участие хромосом в обменных перестройках в соответствии с количеством содержащейся в них ДНК.

В 1989 г . Meyne и соавт. [59] впервые применили флуоресцентные ДНК зоны, способные связываться с центромерами всех хромосом, для оценки частоты дицентриков. Одновременное использование для анализа проб, специфичных для определенных хромосом и центромер, позволило не только определять структурные перестройки хромосом, но и классифицировать их на стабильные и нестабильные [91].

Так же как и для биологической дозиметрии, основанной на анализе частоты дицентриков, необходимой предпосылкой для практического применения FISH метода в дозиметрических исследованиях является получение калибровочных кривых «доза-эффект» для симметричных транслокаций. В ряде работ представлены зависимости «доза-эффект» для радиационно-индуцированных хромосомных аберраций, полученные в эксперименте при облучении лимфоцитов крови in vitro , и последующим анализом с помощью FISH метода [17, 18, 42, 55, 63, 80].

Анализ частоты стабильных аберраций хромосом с применением FISH метода на сегодняшний день является «золотым стандартом» ретроспективной биологической дозиметрии [87]. По частоте транслокаций в лимфоцитах периферической крови можно оценить уровень облучения в широком диапазоне доз не только при остром однократном, но и при пролонгированном радиационном воздействии с низкой мощностью дозы [45]. Ретроспективная оценка доз основана на постулатах о равном соотношении частот транслокаций и первоначально индуцированных дицентриков, неизменном уровне транслокаций в течение длительного времени после облучения и вероятностном характере участия всех хромосом в их образовании. Основанный на анализе двуцветных структур, FISH метод позволяет сравнительно быстро анализировать значительное количество клеточного материала и выявлять хромосомные повреждения с высокой степенью надежности. Это в свою очередь улучшает качество биологической дозиметрии, особенно в области малых доз. Эффективность оценки частоты транслокаций с помощью FISH метода значительно превышает метод с использованием дифференциального окрашивания.

Первые работы, в которых FISH метод был применен для целей биологической дозиметрии, появились в 1989-1995 гг. Наиболее масштабными являются обследования хибакуся в Японии [25, 26, 27, 48] и участников ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС [74, 75]. В работах показана высокая чувствительность FISH метода для анализа транслокаций, а также хорошее совпадение с результатами, полученными при использовании альтернативных методов биологической и физической дозиметрии.

Salassidis и соавт. [74, 75] провели цитогенетическое обследование с применением FISH метода 15 участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, находящихся на лечении в Германии. Параллельно был апробирован метод, основанный на анализе распределения дицентриков и центрических колец по клеткам. Оценка индивидуальных доз обоими методами дала хорошее совпадение. Значения доз для 12 из 15 человек составили от 1,1 до 5,8 Гр.

В 1991 году проведено исследование частоты транслокаций FISH методом в лимфоцитах крови рабочей, подвергшейся воздействию бета-излучения трития в результате аварии, имевшей место в 1985 году [56]. Сразу после аварии была определена доза по частоте дицентриков, а через 6 лет – по частоте транслокаций. Данные, полученные двумя методами, практически не отличались.

К настоящему времени опубликовано большое количество работ по результатам применения FISH метода для цитогенетического обследования людей, которые были облучены в результате аварийных и чрезвычайных ситуаций [2, 12, 15, 16, 23, 24, 31, 32, 51, 52, 76, 77, 82, 83, 84, 85]. Результаты, представленные в этих исследованиях, демонстрируют высокую чувствительность и эффективность FISH метода для ретроспективной оценки индивидуальных и среднегрупповых доз облучения.

Уровень транслокаций, в отличие от дицентриков, является интегральным показателем, отражающим влияние на организм факторов как радиационной, так и нерадиационной природы. Спонтанный уровень транслокаций примерно в 10 раз превышает соответствующий уровень дицентриков и характеризуется значительно большей индивидуальной вариабельностью (от 1 до 20 транслокаций на 1000 клеток), что, по-видимому, связано с влиянием на него факторов разной природы. Как показали многочисленные исследования, основной из них – курение. Влияние курения на увеличение частоты транслокаций убедительно продемонстрировано в ряде работ [71, 84], хотя есть и иное мнение на этот счет [68, 92].

В настоящее время получены убедительные данные, что с возрастом частота транслокаций увеличивается [81, 92]. По мнению Lucas и соавт. [57] фоновый уровень радиации лишь незначительно влияет на возрастное увеличение частоты транслокаций. Основной причиной, приводящей к более интенсивному образованию хромосомных аберраций с возрастом, является угнетение механизмов, обеспечивающих защиту клетки от воздействия генотоксических факторов. Выявление возрастных изменений частоты транслокаций в необлученных популяциях имеет большое значение при проведении ретроспективной дозиметрии, особенно в области низких доз. Учет возрастной зависимости хромосомных аберраций, а также факторов нерадиационной природы, способных оказывать модифицирующее влияние на уровень транслокаций, позволяет снизить межиндивидуальную вариабельность и, соответственно, увеличить точность в оценке доз [88].

Определение дозы с помощью FISH метода усложняется при облучении в малых дозах или в условиях хронического облучения, т.к. относительно высокий спонтанный уровень симметричных транслокаций предполагает анализ большого числа клеток [88].

При облучении в больших дозах (более 2 Гр), в том числе при неравномерном радиационном воздействии на организм, существует вероятность недооценки доз, определяемых по частоте транслокаций. Это связано с тем, что часть клеток может содержать одновременно как стабильные, так и нестабильные хромосомные аберрации. При элиминации со временем после облучения клеток с нестабильными хромосомными аберрациями происходит, соответственно, и снижение частоты стабильных хромосомных аберраций. Поэтому представляется целесообразным анализировать частоту транслокаций только в стабильных клетках, если облучение было в дозах, превышающих 2 Гр. При облучении в более низких дозах такой проблемы не существует, т.к. вероятность образования клеток со стабильными и нестабильными аберрациями значительно ниже.

Проблема биологической дозиметрии с использованием цитогенетического анализа, особенно после аварии на Чернобыльской АЭС, приобрела особую актуальность. Цитогенетические повреждения в лимфоцитах периферической крови являются объективным, высокочувствительным критерием степени радиационного воздействия в раннем и отдаленном периодах после облучения и могут успешно использоваться для биологической индикации ионизирующего излучения и оценки полученной дозы. В отдельных случаях по результатам цитогенетического анализа можно не только судить о дозе облучения, но и определять характер радиационного воздействия и вид ионизирующего излучения.

Цитогенетические методы дозиметрии, как наиболее доступные и относительно простые, приобрели статус необходимых исследований не только в случаях аварийных ситуаций в атомной промышленности. Отличаясь достаточно высокой чувствительностью, они широко используются при обследовании профессионалов, включая космонавтов, а также различных категорий населения, подвергающегося воздействию низких доз ионизирующего излучения.

Анализ нестабильных хромосомных аберраций позволяет провести количественную оценку радиационного воздействия только в ранние сроки после облучения. Однако даже при значительном периоде времени, прошедшем после облучения, в крови пострадавших людей наблюдается повышенная частота нестабильных хромосомных аберраций, в том числе маркеров радиационного воздействия – дицентриков и центрических колец, которая в ряде случаев коррелирует с уровнем дозовых нагрузок.

Достоверная ретроспективная оценка доз в случае аварийных и чрезвычайных ситуаций возможна только по частоте стабильных хромосомных аберраций – транслокаций. При этом очень важно учитывать характер радиационного воздействия, вид излучения, диапазон доз, а также возраст обследуемых.

В отличие от доз, полученных с помощью физических или расчетных методов дозиметрии, «биологическая» доза, оцененная по частоте хромосомных аберраций, является интегральным показателем повреждающего действия радиации, который учитывает индивидуальную радиочувствительность. Информация о «биологической» дозе позволяет более точно прогнозировать возможные последствия радиационного воздействия.

1. Бурлакова Е.Б. Эффект сверхмалых доз // Вестник РАН. – 1994. – Т. 64. — №5. – С. 425.

2. Воробцова И.Е., Богомазова А.Н. Стабильные хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови лиц, пострадавших в результате аварии на ЧАЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1995. – Т.35. — №5. — С.636-639.

3. Дубинина Л.Г. Лейкоциты крови человека – тест-система для оценки мутагенов среды. / Дубинина Л.Г. – Москва: Наука, 1977. – 152с.

4. Кузин А.М. Идеи радиационного гормезиса в атомном веке. / Москва: Наука, 1995. – 158 с.

5. Мазник Н.А., Винников В.А. Уровень аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови у эвакуантов из 30-км зоны ЧАЭС, у жителей радиоактивно-загрязненных территорий в отдаленные сроки после Чернобыльской аварии. // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2002. – Т.42. — №6. – С.704-710.

6. Мазник Н.А. Результаты динамического цитогенетического обследования и биологической дозиметрии у лиц, эвакуированных из 30-километровой зоны ЧАЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2004. – Т.44. — №5. – С 566-573.

7. Мазурик В.К. Биохимическая индикация лучевого поражения // Под редакцией Кудряшова Ю.Б. / Москва: Изд-во МГУ, 1987. – С.100-103.

8. Нугис В.Ю., Филюшкин И.В., Чистопольский А.С. Сопоставление частоты хроматидных аберраций с дозой, оцененной по частоте дицентриков, при цитогенетическом обследовании у лиц, пострадавших при аварии на Чернобыльской АЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1996. – Т.36. — №6. – С.815-824.

9. Нугис В.Ю., Дудочкина Н.Е. Цитогенетические показатели в отдаленные сроки после острого облучения людей. Компьютерный метод ретроспективной оценки дозы // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2007. – Т.47. — №1. – С.74-79.

10. Обухова Т.Н., Домрачева Е.В. Регистрация стабильных аберраций в лимфоцитах периферической крови методом G-дифференциального окрашивания хромосом и FISH // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1998. – Т.38. — №6. – С.793-799.

11. Пилинская М.А., Шеметун А.М., Дыбский С.С. и др. Цитогенетический мониторинг лиц, пострадавших от аварии на Чернобыльской АЭС // Цитология и генетика. – 1994. – Т.28. — №3. – С.18-24.

12. Пилинская М.А. Последние достижения радиационной цитогенетики в связи с открытием метода флюоресцентной гибридизации in situ метафазных хромосом человека и экспериментальных животных с ДНК-зондами (FISH) // Цитология и генетика. – 1996. – Т.30. — №4. – С.70-85.

13. Севанькаев А.В., Насонов А.П. Биологическая дозиметрия по хромосомным аберрациям в культуре лимфоцитов человека // Методические рекомендации. – Обнинск: МЗ СССР, 1979. – 13с.

14. Севанькаев А.В., Моисеенко В.В., Цыб А.Ф. Возможности применения методов биологической дозиметрии для ретроспективной оценки доз в связи с последствиями аварии на Чернобыльской АЭС. Оценка доз на основе анализа нестабильных хромосомных аберраций // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1994. – Т. 34. — № 6. – С.782-792.

15. Севанькаев А.В., Голуб Е.В., Хвостунов И.К. и др. Ретроспективная оценка доз в отдаленный пострадиационный период разными биологическими методами // Радиационная биология. Радиоэкология. – 2004. – Т.44. — №6. – С.637-652.

16. Снигирева Г.П., Шевченко В.А., Новицкая Н.Н. Использование FISH метода для реконструкции поглощенных доз, полученных участниками ликвидации аварии на Чернобыльской АЭС. // Радиационная биология. Радиоэкология. 1995. — Т.35.- Вып.5. — С.654-661.

17. Снигирева Г.П., Хаймович Т.И., Шевченко В.А. Использование цитогенетических методов для биологической дозиметрии. Методические рекомендации. / Саров. — 2003. – 46с.

18. Снигирева Г.П., Богомазова А.Н., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д., Рубанович А.В. «Биологическая индикация радиационного воздействия на организм человека с использованием цитогенетических методов». Медицинская технология. / Москва. – 2007.- Регистрационное удостоверение №ФС-2007/015-У. – 29с.

19. Снигирева Г.П., Богомазова А.Н., Новицкая Н.Н., Хазинс Е.Д. Результаты многолетнего цитогенетического наблюдения за участниками ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС. // Медицинская радиология и радиационная безопасность. — 2008. — №4. — С.38-45

20. Спитковский Д.М. Концепция действия низких доз ионизирующей радиации на клетки и ее возможное использование для интерпретации медико-биологических последствий аварии на ЧАЭС // Радиационная биология. Радиоэкология. – 1992. – Т.32. — №3. – С.382-400.

21. Федоров Н.А. Нормальное кровообращение и его регуляция / Москва: Медицина, 1966. – 467с.

22. Шевченко В.А., Померанцева М.Д. Генетические последствия действия ионизирующих излучений. / Москва: Наука. — 1985. – 279 с.

23. Шевченко В.A., Снигирева Г.П., Сусков И.И., Акаева Е.А., Елисова Т.В., Иофа Э.Л., Нилова И.Н., Костина Л.Н., Новицкая Н.Н., Сидорова В.Ф., Хазинс Е.Д. Цитогенетические эффекты у населения Алтайского края, подвергшегося воздействию ионизирующих излучений в результате ядерных взрывов на Семипалатинском полигоне. // Радиационная биология. Радиоэкология. — 1995. — Т.35. — Вып.5.- С. 588-596.

24. Шевченко В.А., Снигирева Г.П. Значимость цитогенетического обследования для оценки последствий Чернобыльской катастрофы. // Радиационная биология. Радиоэкология. — 2006. — Т.46.- №2. — С.133-139.

25. Awa A., Sofuni T., Honda T. et al. Relationship between the radiation dose and chromosome aberrations in atomic bomb survivors of Hiroshima and Nagasaki // Journal of Radiation Research. – 1978. – V.19. – P.126-140.

26. Awa A.A. Chromosome aberrations in A-bomb survivors, Hiroshima and Nagasaki . / In: «Chromosomal aberrations», (G. Obe, A.T. Natarajan Eds.). P.181-190. Springer-Verlag , Berlin , Heidelberg , New York , London , 1990.

27. Awa A.A., Nakano M., Ohtaki K. et al. Factors that determine in the in vivo dose-response relationship for stable chromosome aberration in A-bomb survivors // Radiation Research. – 1992. – V.38. – P.206-214.

28. Bajerska A., Liniecki J. The yield of chromosomal aberrations in rabbit lymphocytes after irradiation in vitro and vivo // Mutation Research. — 1975. — V.27. — №2. — P. 271-284.

29. Bauchinger M. Chromosome painting and biological dosimetry of absorbed radiation // Tenth International Congress of Radiation Research. – 1995. — V.2-Congress Lectures. — P. 485-488.

30. Bauchinger M., Shmid E., Braselmann H. et al. Time-effect relationship of chromosome aberrations in peripheral lymphocytes after radiation therapy for seminoma // Mutation Research. – 1989. — №211. – P.265-272.

31. Bauchinger M., Salassidis K., Braselmann H. et al. FISH-based analysis of stable translocations in a Techa River population // International Journal of Radiation Biology. – 1998. – V.73. — №6. — P605-612.

32. Bauchinger M., Braselmann H., Savage J. R., Natarajan A. T., Terzoudi G. I., Pantelias G. E., Darroud F., Figgitt M., Griffin C. S., Knehr S., Okladnikova N.D., Santos S. and Snigiryova G. Сollaborative exercise on the use of FISH chromosome painting for retrospective biodosimetry of Mayak nuclear-industrial personnel // International Journal of Radiation Biology. — 2001.- V.77. — N3.- P.259-267.

33. Bender M.A., Awa A., Brooks A.L. et al. Current status of cytogenetic procedures to detect and quantify previous exposures to radiation // Mutation Research. – 1988. – V.196. – P.103-159.

34. Bogen K.T. Reassessment of human peripheral T-lymphocyte lifespan deduced from cytogenetic and cytotoxic effects of radiation // International Journal of Radiation Biology. – 1993. – V.64. — №2. – P.195-204.

35. Bonassi S., Kirsh-Volders M., Stromberg U. et al. Human population studies with cytigenetic biomarkers; review of literature and future prospectives // Environmental and Molecular Mutagenesis. — 2005. – V.45. — №2-3. – P. 258-270.

36. Brewen J.G., Preston R.J., Littlefield L.G. Radiation-induced human chromosome aberration yields following an acc > Research. – 1972. — V. 49. — P.647-656.

37. Brogger A Hagmar L., Hansteen I-L. et al. //Cancer risk in humans predicted by increased levels of chromosomal aberrations in lymphocytes: Nordic study group on the health risk of chromosome damage. // Cancer Research. – 1994. – V. 54. — P. 2919–2922.

38. Brooks A.L. Biomarkers of exposure and dose: state of the art // Radiation Protection Dosimetry. – 2001. – V.97. — №1. – P.39-46.

39. Buckton K.E. > breakage points induced in human chromosomes by in vitro X-irradiation // International Journal of Radiation Biology. – 1976. – V.29. – P.475-488.

40. Buckton K.E., Hamilton G.E., Paton L. et al. Chromosome aberrations in irradiated ankylosing spondylitis patients // Mutagen-induced chromosome damage in man. – 1978. – P.142-150.

41. Chung H.W., Ryu E.K., Kim Y.J., Ha S.W. Chromosome aberrations in workers of nuclear-power plants // Mutation Research. — 1996. – V.350. – P.307-314.

42. Cremer T., Popp S., Emmerich P., and Cremer C., Rap > suppression in situ hybridization // Cytometry. – 1990. – V.11. – P.110-118.

43. Durante M., Snigiryova G., Akaeva E., Bogomazova A., Druzhinin S., Fedorenko B., Greco O., Novitskaya N., Rubanovich A., Shevchenko V., Recklinhausen U. von and Obe G. Chromosome aberration dosimetry in cosmonauts after single or multiple space flights. // Cytogenetic Genome Research. — 2003. — V.103.- P.40-46.

44. Fernander J.L., Campos A., Goyanes V. et al. X-ray biological dosimetry performed by selective painting of human chromosomes 1 and 2 // International Journal of Radiation Biology. – 1995. – V.67. – №3. — P.295-302.

45. Hsieh W.A., Lucas J.H., Hwang J.J. et al. Biodosimetry using chromosomal translocations measured by FISH in a population chronically exposed to low dose-rate 60Co (-irradiation // International Journal of Radiation Biology. – 2001. – V. 77. – №7. — P.797-804.

46. IAEA: Technical Report series №260, «Biological dosimetry: chromosomal aberration analysis for dose assessment». IAEA, Vienna – 1986. – 69 p.

47. IAEA: Cytogenetic analysis for radiation dose assessment. Technical Report series №405. International Atomic Energy Agency. Vienna – 2001. — 127 p.

48. Kodama Y., Nakano M., Ohtaki K. et al. Biotechnology Contributes to Biological Dosimetry. – RERF, Winter 1992-93. – P.6-7.

49. Leonard A., Deknudt Gh. and Leonard E.D. Persistence of chromosome aberrations in an accidentally irradiated subject // Radiation Protection Dosimetry. – 1988. – V.22. — № 2. — P.55-57.

50. Lindholm C., Romm H., Stephan G., et al. Intercomparison of translocation and dicentric frequencies between laboratories in a follow-up of the radiological acc > Estonia // International Journal of Radiation Biology. – 2002. – V.78. — №10. – P.883-890.

51. Lindholm C., Edwards A.A. Long-term persistence of translocation in stable lymphocytes from victims of a radiological accident // International Journal of Radiation Biology. – 2004. – V.80. – P.559-566.

52. Livingston G.K., Falk R.B., Schmid E. Effect of occupational radiation exposures on chromosome aberration rates in former plutonium workers // Radiation Research. – 2006. – V.166. – P.89-97.

54. Lloyd D.C., Edwards A.A., Prosser J.S. et al. Accidental intake of tritiated water: a report of two cases // Radiation Protection Dosimetry. – 1986. — V.15. — P.191-196.

55. Lucas J.N., Tenjin T., Straume T. et al. Rapid human chromosome aberration analysis using fluorescence in situ hybridization // International Journal of Radiation Biology. – 1989. – V. 56. – №1. — P.35-44.

56. Lucas J.N., Awa A., Straume T. et al. Rapid translocation frequency analysis in humans decades after exposure to ionizing radiation // International Journal of Radiation Biology. – 1992. – V. 62. – №1. — P.53-63.

57. Lucas J.N., Deng W. Views on issues in radiation biodosimetry based on chromosome translocations measured by FISH // Radiation Protection Dosimetry. – 2000. – V.88. – P.77-86.

58. Maznik N.A., Vinnikov V.A. Retrospective cytogenetic biodosimetry using fluorescence in situ hybridization (FISH) technique in persons exposed to radiation due to the Chernobyl accident // Украiнський Радiологичнiй Журнал. – 2005. – Т.13. – С.66-72.

59. Meyne J., Littlefield L.G., Moyzis R.K. Labeling of human controllers using an alphoid DNA consensus sequence: application to the scoring of chromosome aberrations // Mutation Research. – 1989. – V. 226. – P.75-76.

60. Moorchead P.S., Nowell P.C., Mellman W.L. et al. Chromosome preparation of leukocytes cultured from human peripheral blood // Experimental Cell Research. – 1960. – V.20. — №3. – P.613-616.

61. Mothersill C., Seymour C.B. Radiation-induced bystander effects — implications for cancer // National Review of Cancer. — 2004. – V.4. — №2. – P. 158-164.

62. Nakano M., Kodama Y., Ohtaki K. Detection of stable chromosome aberration by FISH in A-bomb survivors: Comparison with previous solid Giemsa staining data on the same 230 individuals // International Journal of Radiation Biology. – 2001. – V.77. — №9. – P.971-977.

63. Natarajan A.T., Vyas R.C., Darroudi F., Vermenlen S. Frequencies of X-ray-induced chromosome translocation in human peripheral lymphocytes as detected by in situ hybridization using chromosome-specific DNA libraries // International Journal of Radiation Biology. – 1992. – V. 61. – №2. — P.199-203.

64. Chromosomal Alterations. Methods, Results and Importance in Human Health. Editors Obe G. and Vijayalaxmi. – Springer, 2007. — 515 p.

65. Ohtaki K. G-banding analysis of radiation-induced chromosome damage in lymphocytes of Hiroshima A-bomb survivors // Japanese Journal of Human Genetics. – 1992. – V.37. — №4. – P.245-262.

66. Pinkel D., Straume T. and Gray J., Cytogenetic analysis using quantitative, high-sensitivity, fluorescence hybr > // Proceeding of the National Academy of Sciences ( USA ). – 1986. – V.83. – P.2934-2938.

67. Pohl-Ruling J., Haas O., Brogger A., Obe G. et al. The effect on lymphocyte chromosomes at additional radiation burden due to fallout in Salzburg ( Austria ) from the Chernobyl accident // Mutation Research. – 1991. — V.262. – P.209-217.

68. Pressl S., Romm H., Ganuly B., Stephan G. Experience with FISH-detected translocations as an indicator in retrospective dose reconstructions // Radiation Protector Dosimetry. – 2000. – V.88. – P.45-49.

69. Ramalho A.T., Nascemento A.C.H. The fate of chromosomal aberrations in 137Cs-exposed indiv > Goiania radiation accident // Health Physics. – 1991. – V.60. — №1. – P. 67-70.

70. Ramalho A.T., Curado M.P., Natarajan A.T. Lifespan of human lymphocytes estimated during a six year cytogenetic follow-up of individuals accidentally exposed in the 1987 radiological accident in Brazil // Mutational Research. — 1995. – V.331. — №1. – P.47-54.

71. Ramsey M.J., Moore D.H., Briner J.F. et al. The effects age and lifestyle factors on the accumulation of cytogenetic damage as measured by chromosome painting // Mutation Research. – 1995. – V.338. – P.95-106.

72. Rodriguez P., Montoro A., Barquinero J.F. et al. Analysis of translocations in stable cells and their implications in retrospective biological dosimetry // Radiation Research. – 2004. – V.162. – P.31-38.

73. Rossner P., Boffetta P., Ceppi M. et al. Chromosomal aberrations in lymphocytes of healthy subjects and risk of cancer // Environment Health Perspective. – 2005. –V.113. — №5. – P.517-520.

75. Salass > Chernobyl victims: a follow-up study to evaluate the stability of symmetrical translocations and the influence of clonal aberrations for retrospective dose estimation // International Journal of Radiation Biology. – 1995. – V. 68. – №3. — P.257-262.

76. Salass > Analysis of symmetrical translocations for retrospective biodosimetry in radiation workers of the Mayak nuclear-industrial complex ( Southern Urals ) using FISH-chromocome painting. // International Journal of Radiation Biology. — 1998. — V.74. — N.4. — P.431-439.

77. Salomaa S., Sevan’kaev A.V., Zhloba A.A. et al. Unstable and stable chromosomal aberrations in lymphocytes of people exposed to Chernobyl fallout in Bryansk, Russia // International Journal of Radiation Biology. – 1997. – V.71. — №1. — P.51-59.

78. Scheid W., Weber J., Traut H. Chromosome aberrations induced in human lymphocytes by an X-radiation accident: results of a 4-year postirradiation analysis. // International Journal of Radiation Biology. -1988. – V.54. — №3. – P.395-402.

79. Schm > et al. Comparison of the chromosome damage and its dose response after medical whole-body exposure to 60Co gamma-rays and irradiation of blood in vitro // International Journal of Radiation Biology. – 1974. – V. 26. – P.31-37.

80. Schmid E., Zitzelsberger H., Braselmann H. et al. Radiation induced chromosome aberrations analysed by fluorescence in situ hybridization with a triple combination of composite whole chromosome-specific DNA probes // International Journal of Radiation Biology. – 1992. – V. 62. – №6. — P.673-678.

81. Sigurdson A.J., Ha M., Hauptmann M. et al. International study of factors affecting human chromosome translocations in peripheral blood lymphocytes // Mutation Research. – 2008. – V.652. – P.112-121.

82. Snigiryova G., Braselmann H., Salass > painting and conventional chromosome analysis. // International Journal of Radiation Biology. — 1997. — V.71.- N.2. — P. 119-127.

83. Stephan G., Pressl S., Koshpessova G., Gusev B.I. Analysis of FISH-painted chromosomes in individuals living near the Semipalatinsk nuclear test site // Radiation Research. – 2001. – V.155. — №6. – P.796-800.

84. Tawn E.J., Whitehouse C.A. Persistence of translocation frequencies in blood lymphocytes following radiotherapy: implications for retrospective radiation biodosimetry // Journal of Radiology Protection. – 2003. – V. 23. — №4. – P.423-30.

85. Tawn E.J., Whitehouse C.A. , R > 2006. – V.165. — №5. – P.592-597.

86. Tucker J.D., Ramsey M.J., Lee D.A., Minkler J.L. Validation of chromosome painting as a biodosimeter in human peripheral lymphocytes following a cute exposure to ionizing radiation in vitro // International Journal of Radiation Biology. – 1993. – V. 64. — №1. – P.27-37.

87. Tucker J.D. Sensitivity, specificity and persistence of chromosome translocations for radiation biodosimetry // Military Medicine. – 2002. – V.167 (2 Suppl.) – P.8-9.

88. Tucker J.D. Low-dose ionizing radiation and chromosome translocations: A review of the major considerations for human biological dosimetry // Mutation Research. – 2008. — V.659. — №3. – P.211-220.

89. UNSCEAR, 2000 Report to the General Assembly. Annex J. Exposure and effects of the Chernobyl accident // International Journal Radiation Medicine. – 2000. — Special issue 2-4 (6-8). – P.3-109.

источник