Практическое значение анализа изоферментных спектров в крови

22. Изоферменты, их происхождение, биологическое значение, привести примеры. Определение ферментов и изоферментного спектра плазмы крови с целью диагностики болезней.

Изоферменты. Часть ферментов состоят не из одной белковой цепочки, а из нескольких субъединиц. Изоферменты – это семейство ферментов, которые катализируют одну и ту же реакцию, но отличаются по строению и физико-химическим свойствам .

Например: лактатдегидрогеназа (ЛДГ) состоит их 4 субъединиц 2хтипов: субъединица Н, выделенная из сер дечной мышцы (heart – сердце), субъединица М, выделенная из скелетных мышц (musculus – мышца). Эти субъединицы кодируются разными генами. В разных органах имеются различные формы ЛДГ с различным набором субъединиц. Известно 5 изоферментов ЛДГ:
ЛДГ1: ЛДГ2: ЛДГ3: ЛДГ4: ЛДГ5: (Н4) (Н3М) (Н2М2) (НМ3) (М4)
ЛДГ1 экспрессируется в сердечной мышце и мозге, а ЛДГ5 – в скелетных мышцах и печени. Остальные формы в других органах. Появление ЛДГ в крови свидетельствует о повреждении органов (фермент из разрушенных клеток поступает в кровь – гиперферментемия) Повышение активности фракции ЛДГ1 в крови наблюдается при повреждении сердечной мышцы (инфаркт миокарда), а повышение активности ЛДГ5 в крови наблюдается при гепатитах и повреждении скелетных мышц. То есть благодаря изоферментам можно определить локализацию поврежденного органа. Наиболее чувствительным тестом на инфаркт миокарда является повышение в крови сердечного изофермента креатинкиназы.

23. Энзимопатии наследственные (фенилкетонурия) и приобретенные (цинга). Применение ферментов для лечения болезней.

В основе многих заболеваний лежат нарушения функционирования ферментов в клетке — энзимопатии. Различают первичные (наследственные) и вторичные (приобретённые) энзимопатии. Приобретённые энзимопатии, как и вообще протеинопатии, по-видимому, наблюдают при всех болезнях.

При первичных энзимопатиях дефектные ферменты наследуются, в основном, по аутосомнорецессивному типу. Гетерозиготы, чаще всего, не имеют фенотипических отклонений. Первичные энзимопатии обычно относят к метаболическим болезням, так как происходит нарушение определённых метаболических путей. При этом развитие заболевания может протекать по одному из ниже перечисленных «сценариев». Рассмотрим условную схему метаболического пути:

Вещество А в результате последовательных ферментативных реакций превращается в продукт Р. При наследственной недостаточности какого-либо фермента, например фермента Е3, возможны разные нарушения метаболических путей:

Нарушение образования конечных продуктов. Недостаток конечного продукта этого метаболического пути (Р) (при отсутствии альтернативных путей синтеза) может приводить к развитию клинических симптомов, характерных для данного заболевания:

Накопление субстратов-предшественников. При недостаточности фермента Е₃ будут накапливаться вещество С, а также во многих случаях и предшествующие соединения. Увеличение субстратов-предшественников дефектного фермента — ведущее звено развития многих заболеваний:

Нарушение образования конечных продуктов и накопление субстратов предшественников. Отмечают заболевания, когда одновременно недостаток продукта и накопление исходного субстрата вызывают клинические проявления.

Ферментные препараты широко используют в медицине. Ферменты в медицинской практике находят применение в качестве диагностических (энзимодиагностика) и терапевтических (энзимотерапия) средств. Кроме того, ферменты используют в качестве специфических реактивов для определения ряда веществ. Так, глюкозооксидазу применяют для количественного определения глюкозы в моче и крови. Фермент уреазу используют для определения содержания количества мочевины в крови и моче. С помощью различных дегидрогеназ обнаруживают соответствующие субстраты, например пируват, лактат, этиловый спирт и др.

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;
• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

Б. Применение ферментов в качестве лекарственных средств

Использование ферментов в качестве терапевтических средств имеет много ограничений вследствие их высокой иммуногениости. Тем не менее энзимотерапию активно развивают в следующих направлениях:

• заместительная терапия — использование ферментов в случае их недостаточности;
• элементы комплексной терапии — применение ферментов в сочетании с другой терапией.

Заместительная энзимотерапия эффективна при желудочно-кишечных заболеваниях, связанных с недостаточностью секреции пищеварительных соков. Например, пепсин используют при ахилии, гипо- и анацидных гастритах. Дефицит панкреатических ферментов также в значительной степени может быть компенсирован приёмом внутрь препаратов, содержащих основные ферменты поджелудочной железы (фестал, энзистал, мезим-форте и др.).

В качестве дополнительных терапевтических средств ферменты используют при ряде заболеваний. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин) применяют при местном воздействии для обработки гнойных ран с целью расщепления белков погибших клеток, для удаления сгустков крови или вязких секретов при воспалительных заболеваниях дыхательных путей. Ферментные препараты рибонуклеазу и дезоксирибонуклеазу используют в качестве противовирусных препаратов при лечении аденовирусных конъюнктивитов, герпетических кератитов.

24. Общая схема синтеза и распада пиримидиновых нуклеотидов. Регуляция. Оротацидурия.

Рис. 10-16. Катаболизм пиримидиновых оснований. 1 — дигидропиримидиндегидрогеназа; 2 — дигидропиримидинциклогидролаза; 3 — уреидопропионаза.

Это единственное нарушение синтеза пиримидинов de novo. Оно вызвано снижением активности УМФ-синтазы, которая катализирует образование и декарбоксилирование ОМФ. Поскольку в эмбриогенезе от образования пиримидинов de novo зависит обеспечение синтеза ДНК субстратами, то жизнь плода невозможна при полном отсутствии активности этого фермента. Действительно, у всех пациентов с оротацидурией отмечают заметную, хотя и очень низкую активность УМФ-синтазы. Установлено, что содержание оротовои кислоты в моче пациентов (1 г/сут и более) значительно превосходит количество оротата, которое ежедневно синтезируется в норме (около 600 мг/сут). Снижение синтеза пиримидиновых нуклеотидов, наблюдающееся при этой патологии, нарушает регуляцию КАД-фермента по механизму ретроингибирования, из-за чего возникает гиперпродукция оротата.

Клинически наиболее характерное следствие оротацидурии — мегалобластная анемия, вызванная неспособностью организма обеспечить нормальную скорость деления клеток эритроцитарного ряда. Её диагностируют у детей на том основании, что она не поддаётся лечению препаратами фолиевой кислоты.

Недостаточность синтеза пиримидиновых нуклеотидов сказывается на интеллектуальном развитии, двигательной способности и сопровождается нарушениями работы сердца и ЖКТ. Нарушается формирование иммунной системы, и наблюдается повышенная чувствительность к различным инфекциям.

Гиперэкскреция оротовои кислоты сопровождается нарушениями со стороны мочевыводящей системы и образованием камней. При отсутствии лечения больные обычно погибают в первые годы жизни. При этом оротовая кислота не оказывает токсического эффекта. Многочисленные нарушения в работе разных систем организма вызваны «пиримидиновым голодом».

Для лечения этой болезни применяют уридин (от 0,5 до 1 г/сут), который по «запасному» пути превращается в УМФ.

Нагрузка уридином устраняет «пиримидиновый голод», а поскольку из УМФ могут синтезироваться все остальные нуклеотиды пиримидинового ряда, то снижается выделение оротовои кислоты из-за восстановления механизма ретроингибирования КАД-фермента. Для больных оротацидурией лечение уридином продолжается в течение всей жизни, и этот нуклеозид становится для них незаменимым пищевым фактором.

Кроме генетически обусловленных причин, оротацидурия может наблюдаться:

• при гипераммониемии, вызванной дефектом любого из ферментов орнитинового цикла,

за исключением карбамоилфосфат- синтетазы I. В этом случае карбамоилфосфат, синтезированный в митохондриях, выходит в цитозоль клеток и начинает использоваться на образование пиримидиновых нуклеотидов. Концентрация всех метаболитов, в том числе и оротовой кислоты, повышается. Наиболее значительная экскреция оротата отмечается при недостаточности орнитинкарбамоилтрансферазы (второго фермента орнитинового цикла);

• в процессе лечения подагры аллопуринолом, который превращается в оксипуринолмононуклеотид и становится сильным ингибитором УМФ-синтазы. Это приводит к накоплению оротовой кислоты в тканях и крови.

25. Общая схема синтеза и распада пуриновых нуклеотидов. Регуляция. Подагра.

Когда в плазме крови концентрация мочевой кислоты превышает норму, то возникает гиперурикемия. Вследствие гиперурикемии может развиться подагра — заболевание, при котором кристаллы мочевой кислоты и уратов откладываются в суставных хрящах, синовиальной оболочке, подкожной клетчатке с образованием подагрических узлов, или тофусов. К характерным признакам подагры относят повторяющиеся приступы острого воспаления суставов (чаще всего мелких) — так называемого острого подагрического артрита. Заболевание может прогрессировать в хронический подагрический артрит.

Поскольку лейкоциты фагоцитируют кристаллы уратов, то причиной воспаления является разрушение лизосомальных мембран лейкоцитов кристаллами мочевой кислоты. Освободившиеся лизосомальные ферменты выходят в цитозоль и разрушают клетки, а продукты клеточного катаболизма вызывают воспаление.

Общий фонд сывороточных уратовв норме составляет

1,2 г у мужчин и 0,6 г у женщин. При подагре без образования тофусов (т.е. подагрических узлов, в которых накапливаются ураты натрия и мочевая кислота) количество уратов возрастает до 2-4 г, а у пациентов с тяжёлой формой болезни, сопровождающейся ростом тофусов, может достигать 30 г.

Подагра — распространённое заболевание, в разных странах ею страдают от 0,3 до 1,7% населения. А поскольку сывороточный фонд уратов у мужчин в 2 раза больше, чем у женщин, то они и болеют в 20 раз чаще, чем женщины.

Как правило, подагра генетически детерминирована и носит семейный характер. Она вызвана нарушениями в работе ФРДФ синтетазы или ферментов «запасного» пути: гипоксантин-гуанин- или аденинфосфорибозилтрансфераз.

К другим характерным проявлениям подагры относят нефропатию, при которой наблюдают образование уратных камней в мочевыводящих путях.

26. Синтез дезоксирибонуклеотидов. Рибонуклеотидредуктазный комплекс. Биосинтез тимидиловых нуклеотидов, роль фолиевой кислоты и фолатредуктазы. Регуляция. Противоопухолевые, антивирусные и антибактериальные препараты как ингибиторы синтеза рибо- и дезоксирибонуклеотидов.

Реакцию восстановления НДФ в дезоксипроизводные катализирует рибонуклеотидредуктазный комплекс, в состав которого входят: собственно рибонуклеотидредуктаза (РНР), белок тиоредоксин и фермент тиоредоксинредуктаза, обеспечивающий регенерацию восстановленной формы тиоредоксина .

Рибонуклеотидредуктаза — олигомерный белок, состоящий из двух В₁— и двух В₂-субъединиц, и содержит негеминовое железо в качестве кофактора.

Непосредственным донором водорода в реакции восстановления рибозы служит низкомолекулярный белок тиоредоксин. В рабочую часть этого белка входят 2 SH-группы, которые, отдавая водород, окисляются с образованием дисульфидного мостика. Второй фермент комплекса — тиоредоксинредуктаза — катализирует гидрирование окисленного тиоредоксина с использованием NADPH.

При участии комплекса РНР образуются: dАДФ, dГДФ, dУДФ и dЦДФ, которые с помощью НДФ-киназ превращаются в дНТФ, 3 из которых (кроме дУДФ) непосредственно используются в синтезе ДНК.

Тимидин-5′-монофосфат (дТМФ) образуется из дУМФ в реакции, катализируемой тимидилатсинтазой. Донором метильной группы, появляющейся в 5-положении пиримидинового кольца в молекуле дТМФ, служит кофермент тимидилатсинтазы — N 5 ,N 10 -метилен-Н ₄ -фолат. С помощью этого кофермента в молекулу дУМФ включается метиленовая группа и восстанавливается в метальную, используя 2 атома водорода от Н ₄ -фолата.

Образование субстрата тимидилатсинтазной реакции — дУМФ осуществляется двумя путями

• дефосфорилированием дУДФ;
• гидролитическим дезаминированием дЦМФ с помощью дЦМФ дезаминазы. дЦМФ получается при дефосфорилировании дЦДФ — одного из продуктов рибонуклеотидредуктазной реакции. В организме человека это основной путь образования дУМФ.

Скорость синтеза дТМФ зависит также от количества второго субстрата тимидилатсинтазной реакции — N 5 ,N 10 -метилен-Н₄-фолата, пополнение запасов которого осуществляется при участии 2 ферментов: дигидрофолатредуктазы, которая с участием NADPH восстанавливает Н₂-фолат в Н₄-фолат, и серии гидроксиметилтрансферазы, осуществляющей перенос β-гидроксиметиленовой группы серина на Н₄-фолат. У человека дТМФ образуется, главным образом, из дЦДФ.

Регуляция синтеза дезоксирибонуклеотидов

Рибонуклеотидредуктаза, тимидилатсинтаза и тимидинкиназа — индуцируемые ферменты, их количество в клетке регулируется на генетическом уровне по механизму индукции и репрессии. Синтез этих белков начинает нарастать в G₁-периоде, достигает максимума во время активного синтеза ДНК, снижаясь практически до нуля в G₂— и М-периоды клеточного цикла.

В то же время активность РНР подвержена сложной аллостерической регуляции, с помощью которой достигается сбалансированное образование всех дНДФ.

РНР осуществляет последовательное восстановление всех рибонуклеозиддифосфатов. Первыми восстанавливаются пиримидиновые нуклеотиды, а последним — дАДФ. дАДФ фосфорилируется в дАТФ, накопление которого полностью прекращает восстановление всех остальных рибонуклеозиддифосфатов.

В терапии инфекционных и онкологических болезней, научных исследованиях в области медицины и биологии часто используют синтетические аналоги пуринов и пиримидинов. Введение в организм животного или человека аналога, имеющего изменения в структуре гетероциклического кольца или углеводной компоненты, угнетает активность ферментов, участвующих в метаболизме нуклеотидов, скорость синтеза РНК или ДНК из-за нарушения комплементарных взаимодействий азотистых оснований и роста полинуклеотидных цепей. Аналоги пуринов, пиримидинов и их нуклеозиды нашли применение в качестве антибактериальных, противовирусных и химиотерапевтических средств.

А. Противоопухолевые препараты

Синтезировано очень много аналогов дНТФ, которые включаются ДНК полимеразами в ДНК и ингибируют репликацию. К числу мощных противоопухолевых препаратов принадлежит 5-фторурацил (5-FU) — аналог урацила.

Цитозинарабинозид (или цитарабин) представляет собой соединение, в котором остаток рибозы замещён на стериоизомер — арабинозу. Оно используется в химиотерапии рака, в частности, при острой миелоцитарной лейкемии.

В организме препарат может превращаться в дНТФ, ингибировать ДНК полимеразы и снижать скорость репликации.

источник

Изоферменты отличаются друг от друга несколькими физико-химическими признаками и, в частности, зарядом молекул, поэтому электрофорез издавна используется для их разделения. Изоферменты лактатдегидрогеназы были открыты одними из первых.

Различают пять типов изоферментов ЛДГ, которые в порядке подвижности к аноду обозначаются: ЛДГ₁, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Каждый из них представляет собой тетрамер, отличающийся составом субъединиц (см. учебник, с.226, 438).

Работа 33. Разделение изоферментов лактатдегидрогеназы

сыворотки крови методом электрофореза

в полиакриламидном геле по Дитцу и Лубрано

Использование в качестве среды геля полиакриламида позволяет добиться высокого разрешения при электрофорезе белков и ферментов, поскольку этот гель играет роль молекулярного сита, что обеспечивает дополнительное разделение частиц по молекулярной массе.

Реактивы. Раствор № 1 для полимеризации геля с рН 8,9 (1,0 М соляная кислота – 48 мл, трис-основание – 36,6 г, N,N,N,N-тетраметилэтилендиамин, или ТЕМЕД – 0,23 мл и дистиллированная вода до 100 мл); раствор № 2 (акриламид – 30,0 г, N,N-метиленбисакриламид – 0,8 г и дистиллированная вода до 100 мл); персульфат аммония, 0,14%-ный свежеприготовленный раствор; сахароза, 40%-ный раствор; электродный буфер с рН 8,9 (трис-основание – 6,0 г, глицин – 28,8 г, дистиллированная вода до 1 л; перед употреблением разводят в 10 раз); уксусная кислота, 7%-ный раствор; фосфатный буфер, 0,5 М с рН 7,4; лактат натрия, 1 М раствор; НАД, 10 г/л раствор; нитротетразолиевый синий (НС), 1 г/л раствор; феназинметасульфат (ФМС), 1 г/л раствор; хлорид магния, 0,005 М раствор; хлорид натрия, 0,1 М раствор.

Оборудование. Колба коническая вместимостью 25 мл; пипетки с оттянутым тонким концом; фильтровальная бумага; стеклянные палочки; штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1,5 и 10 мл; резиновые колпачки; аппарат для электрофореза со стеклянными трубочками; источник постоянного напряжения; микроденситометр; спектрофотометр или ФЭК.

Метод основан на разной электрофоретической подвижности изоферментов ЛДГ, положение которых на столбиках полиакриламидного геля выявляется с помощью веществ, переносящих водород от лактата через феназинметасульфат на нитротетразолиевый синий. В результате в месте нахождения фракции ЛДГ выпадает фиолетово-синий осадок диформазана.

Ход определения. Для полимеризации геля берут сухие чистые стеклянные трубочки, закрывают их с одного конца резиновыми колпачками, устанавливают в штативе строго перпендикулярно и вносят в них каплю раствора сахарозы. Затем готовят полимеризующую смесь, состоящую из растворов № 1, № 2, персульфата аммония и дистиллированной воды в соотношении 1:2:4:1. Смеси готовят из расчета 2 мл на одну трубочку.

Приготовленную полимеризующую смесь разливают в стеклянные трубочки, используя по 2 мл на каждую. Затем на поверхность этого раствора осторожно наслаивают 0,2-0,3 мл дистиллированной воды пипеткой с тонким оттянутым концом (это улучшает полимеризацию геля в трубочках, которая протекает без доступа кислорода воздуха, и формирует гладкую поверхность геля). Через 30 мин обычно полимеризация завершается, о чем свидетельствует ясно различимая граница между полиакриламидным гелем и водой. После этого переворачивают трубочки и осторожно стряхивают с геля наслоенную воду, а остатки воды удаляют из трубочки с помощью фильтровальной бумаги.

Стеклянные трубочки с заполимеризованным гелем закрепляют в гнездах верхней камеры для электрофореза. На поверхность геля в трубочке наносят сначала 0.1 мл сыворотки крови, затем такой же объем раствора сахарозы и перемешивают нанесенные жидкости стеклянной палочкой. Осторожно наслаивают на эту жидкость разведенный в 10 раз электродный буфер, заполняя им пространство до верхнего края трубочки.

Нижнюю камеру аппарата заливают тем же электродным буфером, устанавливают верхнюю камеру над нижней так, чтобы нижние концы трубочек были погружены в электродный буфер. Затем верхнюю камеру тоже заполняют электродным буфером.

Аппарат для электрофореза ставят в холодильник. Электроды подключают к источнику постоянного напряжения: нижний электрод к аноду, верхний к катоду (см. рис. 3). В течение первых 10 мин электрофорез проводят при силе тока 2 мА на каждую трубочку. Затем силу тока увеличивают до 4 мА. Длительность электрофореза около 90 мин.

Пока идет электрофорез, для выявления изоферментов ЛДГ готовят в колбе инкубационную смесь следующего состава: растворы лактата натрия, хлорида магния, НАД – по 1 мл, фосфатного буфера и НС – по 2,5 мл и ФМС– 0,25 мл. Перемешивают содержимое колбочки.

По окончании электрофореза гели извлекают из трубочек. Для этого используют шприц на 10-20 мл с тонкой длинной иглой. Вводят иглу между стенкой трубочки и гелем. Круговыми движениями отслаивают гель, постоянно выдавливая воду из шприца и продвигая иглу к противоположному концу трубки. При этом столбик геля легко выскакивает из трубки.

Столбик геля помещают в пробирки диаметром 7-8 мм и наливают в них инкубационную смесь так, чтобы весь столбик геля был погружен в проявляющую жидкость. Пробирки ставят в термостат при 37˚С на 40-60 мин. Изоферменты ЛДГ выявляются в виде сине-фиолетовых колец на столбике геля.

По истечении инкубации столбики геля промывают водой, переносят в пробирки, содержащие раствор уксусной кислоты, и хранят в темноте.

Количественную обработку гелевых изоэнзимограмм проводят спектрофотометрическим методом или посредством денситометрии. В первом случае лезвием вырезают окрашенные участки геля, помещают их в пробирки и заливают 1 мл подогретого до +80-85˚С раствора диметилформамида. Затем окрашенную жидкость сливают в микрокюветы и измеряют экстинкцию на спектрофотометре или ФЭКе при 540 нм против раствора диметилформамида.

Второй способ обработки заключается в сканировании гелей на микроденситометре. Денситограммы подвергаются количественной обработке.

Расчет. Относительную активность каждого изофермента х (%) выражают в процентах от суммы экстинкций всех изоферментов ЛДГ:

где Е – экстинкция элюата изофермента из зоны геля, относящаяся к данному изоферменту;

∑Е – сумма экстинкций всех изоферментов;

А – активность ЛДГ сыворотки крови, ммоль/(ч·л).

Оформление работы. Зарисовать полученную изоэнзимограмму и рассчитать относительную активность изоферментов ЛДГ (в %). Сделать вывод о сдвигах спектра изоферментов ЛДГ в исследуемой сыворотке и указать на вероятные причины этого явления.

Практическое значение работы. Состав изоферментов ЛДГ имеет внутриклеточную, тканевую и видовую специфичность. Тканевые различия изоферментного спектра ЛДГ явились предпосылкой для использования его в диагностике и прогнозе ряда заболеваний, сопровождающихся некрозом органов и тканей. Известно, что в сердечной мышце, нервной ткани, почках высокая активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (изоферменты Н-типа), в поджелудочной железе и легочной ткани преобладает ЛДГ₃, а в скелетной мышце и печени – ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (изоферменты М-типа). При некрозе этих тканей находящиеся в них изоферменты поступают в кровь и изменяют ее нормальный спектр. В норме сыворотка крови имеет примерно следующие соотношения изоферментов (в % от общей активности): ЛДГ₁ – 32, ЛДГ₂ – 47, ЛДГ₃ – 12, ЛДГ₄ – 5, ЛДГ₅ – 4. При инфаркте миокарда в сыворотке крови увеличивается доля ЛДГ₁ и ЛДГ₂ (спектр смещается в сторону изоферментов Н-типа), причем этот сдвиг определяется размерами очага некроза в сердце. Заживление сопровождается нормализацией состава изоферментов в сыворотке крови.

При инфекционном гепатите повышена относительная активность ЛДГ₄ и ЛДГ₅. Если она сохраняется при клиническом выздоровлении, то это свидетельствует о незавершенности восстановительных процессов в печени.

При поражении поджелудочной железы (панкреатит), легочной ткани увеличивается относительная активность ЛДГ₃ в сыворотке крови.

Работа 34. Определение активности γ-глутамилтрансферазы

Дата добавления: 2014-11-06 ; Просмотров: 452 ; Нарушение авторских прав? ;

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

источник

Ферменты присутствуют в биологических объектах в малых концентрациях, поэтому больший интерес представляет не количественное содержание ферментов, а их активность. Принятая международная единица активности ферментов (ME) соответствует такому количеству фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата за 1 мин в оптимальных для данного фермента условиях. В Международной системе единиц (СИ) единицей активности ферментов является катал (кат) — количество фермента, необходимое для каталитического превращения 1 моля субстрата за 1 сек.

По субстратной специфичности — способности избирательно ускорять определенную реакцию – различают:

· ферменты, обладающие абсолютной специфичностью (т.е. действующие только на одно конкретное вещество и катализирующие только определенное превращение этого вещества). К этой группе относятся, в частности, ферменты, использующие в качестве субстрата определенные стереоизомеры (например, сахара и аминокислоты L или D ряда). Нпример, уреаза, катализирующая гидролиз мочевины до NH₃ и СО₂, лактатдегидрогеназа, оксидазы D и L аминокислот.

· ферменты, обладающие относительной или групповой специфичностью (т.е. катализирующие превращения молекул, обладающих определенным сходством). Относительная специфичность характерна для многих ферментов, в т.ч. для ферментов класса гидролаз: протеаз, эстераз, фосфатаз.

Скорость катализируемых ферментами реакций зависит от ряда факторов, в первую очередь — от природы фермента, обладающего низкой или высокой активностью, а также от концентрации субстрата, наличия в среде активаторов или ингибиторов, температуры и реакции среды (рН). В определенных пределах скорость реакции прямо пропорциональна концентрации субстрата, а начиная с определенной (насыщающей) его концентрации скорость реакции не меняется с возрастанием концентрации субстрата.

Оптимальная температура для активности ферментов составляет обычно 40-50°С. При более низкой температуре скорость ферментативной реакции, как правило, снижается, а при 0°С функционирование ферментов прекращается. При превышении оптимальной температуры скорость реакции снижается, а затем реакция полностью прекращается вследствие постепенной денатурации белков и инактивации. Отдельные ферменты различаются по оптимальному для их действия значению рН. Многие ферменты наиболее активны при величине рН, близкой к нейтральной (рН около 7,0), но ряд ферментов имеет оптимум рН вне этой области. Так, пепсин наиболее активен в сильнокислой среде (рН 1,0-2,0), а трипсин — в слабощелочной (рН 8,0-9,0).

Существенное влияние на активность ферментов оказывает наличие в среде определенных химических веществ: активаторов, повышающих активность ферментов, и ингибиторов, подавляющих ее. Часто одно и то же вещество служит активатором одних ферментов и ингибитором других. Ингибирование ферментов может быть обратимым и необратимым. Определяемая в норме активность ферментов в сыворотке крови есть результат сбалансированности скорости, с которой ферменты синтезируются внутри клеток и выходят из них, со скоростью удаления ферментов из внеклеточной жидкости путем инактивации и разрушения и их экскреции.

При различных заболеваниях часто наблюдается изменение активности ферментов в биологических жидкостях. Это может быть обусловлено рядом причин. Повышение активности может быть результатом ускорения процессов синтеза (например, щелочная фосфатаза при рахите, гепатите), некроза клеток (например, креатинкиназа, аспарагиновая трансаминаза при инфаркте миокарда), понижения выведения (например, щелочная фосфатаза при закупорке желчных путей), повышения проницаемости клеточных мембран (например, аспарагиновая трансаминаза, аланинаминотрансфераза при вирусном гепатите).

Большинство ферментов функционирует в тех клетках, в которых происходит их биосинтез. Исключение составляют пищеварительные ферменты, секретируемые в пищеварительный тракт, ферменты плазмы крови, участвующие в процессе свертывания крови, и некоторые другие.

Многие ферменты характеризуются наличием изоферментов — молекулярных разновидностей ферментов. Катализируя одну и ту же реакцию, изоферменты могут различаться по ряду физико-химических свойств (по первичной структуре, субъединичному составу, оптимуму рН, термостабильности, чувствительности к активаторам и ингибиторам, сродству к субстратам и т.д.). Множественные формы ферментов включают:

· генетически детерминированные изоферменты (например, лактатдегидрогеназа)

· негенетические изоферменты, образующиеся в результате химической модификации исходного фермента или его частичного протеолиза (например, изоферменты пируваткиназы).

Различные изоформы одного фермента могут быть специфичны для разных органов и тканей или субклеточных фракций. Как правило, многие ферменты присутствуют в тканях в разных концентрациях и часто в разных изоформах, хотя известны и ферменты, специфичные для определенных органов.

Регуляция активности ферментативных реакций многообразна. Она может осуществляться за счет изменения факторов, влияющих на активность ферментов, в т.ч. рН, температуры, концентрации субстратов, активаторов и ингибиторов. Так называемые аллостерические ферменты способны в результате присоединения к их некаталитическим участкам метаболитов — активаторов и ингибиторов — изменять стерическую конфигурацию белковой молекулы (конформацию). За счет этого изменяется взаимодействие активного центра с субстратом и, следовательно, активность ферментов. Возможна регуляция активности ферментов за счет изменения количества его молекул в результате модуляции скорости его биосинтеза или деградации, а также за счет функционирования различных изоферментов.

Ферменты, которые обнаруживаются в норме в плазме или сыворотке крови, условно можно разделить на 3 группы: секреторные, индикаторные и экскреторные

Секреторные ферменты,синтезируясь в печени, в норме выделяются в плазму крови, где играют определенную физиологическую роль. Типичными представителями данной группы являются ферменты, участвующие в процессе свертывания крови, и сывороточная холинэстераза

Индикаторные (клеточные) ферментыпопадают в кровь из тканей, где они выполняют определенные внутриклеточные функции. Один из них находится главным образом в цитозоле клетки (лактатдегидрогеназа, альдолаза), другие – в митохондриях (глутаматдегидрогеназа), третьи – в лизосомах (β-глюкуронидаза, кислая фосфатаза) и т.д. Большая часть индикаторных ферментов в сыворотке крови определяется в норме лишь в следовых количествах. При поражении тех или иных тканей ферменты из клеток «вымываются» в кровь; их активность в сыворотке резко возрастает, являясь индикатором степени и глубины повреждения этих тканей.

Экскреторные ферментысинтезируются главным образом в печени (лейцинаминопептидаза, щелочная фосфатаза и др.). В физиологических условиях эти ферменты в основном выделяются с желчью. При многих патологических процессах выделение экскреторных ферментов с желчью нарушается, а активность в плазме крови повышается.

Особый интерес энзимодиагностики представляет исследование активности индикаторных ферментов в сыворотке крови, так как по появлению в плазме или сыворотке крови ряда тканевых ферментов в повышенных количествах можно судить о функциональном состоянии и поражении различных органов (например, печени, сердечной и скелетной мускулатуры). При остром инфаркте миокарда особенно важно исследовать активность креатинкиназы, АсАТ, ЛДГ и оксибутират-дегидрогеназы.

При заболеваниях печени, в частности при вирусном гепатите в сыворотке крови значительно увеличивается активность АлАТ и АсАТ, глутаматдегидрогеназы и некоторых других ферментов. Большинство ферментов, содержащихся в печени, присутствуют и в других органах. Органоспецифическими ферментамидля печени считаются также гистидаза, сорбитолдегидрогеназа, аргиназа и орнитинкарбамоилтрансфераза. Изменение активности этих ферментов в сыворотке крови свидетельствует о поражении печеночной ткани.

В настоящее время особо важным лабораторным тестом стало исследование активности изоферментов в сыворотке крови, в частности изоферментов ЛДГ. Известно, что в сердечной мышце наибольшей активностью обладают изоферменты ЛДГ₁ и ЛДГ₂, а в ткани печени – ЛДГ₄ и ЛДГ₅ . Установлено, что у больных с острым инфарктом миокарда в сыворотке крови резко повышается активность изоферментов ЛДГ₁ и отчасти ЛДГ₂. Изоферментный спектр ЛДГ в сыворотке крови при инфаркте миокарда напоминает изоферментный спектр сердечной мышцы. Напротив, при паренхиматозном гепатите в сыворотке крови значительно возрастает активность изоферментов ЛДГ₄ и ЛДГ₅ и уменьшается активность ЛДГ₁ и ЛДГ₂.

Диагностическое значение имеет также исследование активности изоферментов креатинкиназы в сыворотке крови. Существуют по крайней мере 3 изофермента креатинкиназы: ВВ, ММ и MB. В мозговой ткани в основном присутствует изофермент ВВ (от англ. brain – мозг), в скелетной мускулатуре – ММ-форма (от англ. muscle – мышца). Сердце содержит гибридную МВ-форму, а также ММ-форму. Изоферменты креатинкиназы особенно важно исследовать при остром инфаркте миокарда, так как МВ-форма в значительном количестве содержится практически только в сердечной мышце. Повышение активности МВ-формы в сыворотке крови свидетельствует о поражении именно сердечной мышцы.

Уровень липазы, амилазы, трипсина и химотрипсина в крови резко увеличен при сахарном диабете, злокачественных поражениях поджелудочной железы, болезнях печени и др. Активность кислой фосфатазы (уровень повышен при карциноме предстательной железы), щелочной фосфатазы, холинэстеразы и некоторых других органоспецифических ферментов (например, гистидазы, уроканиназы, глицинамидинотрансферазы) в сыворотке крови при патологии костной ткани, печени, метастатических карциномах

Возрастание активности ферментов сыворотки крови при многих патологических процессах объясняется: выходом в кровяное русло ферментов из поврежденных участков органов или тканей на фоне продолжающегося их биосинтеза в поврежденных тканях; одновременным повышением каталитической активности некоторых ферментов, переходящих в кровь. Возможно, что повышение активности ферментов при «поломке» механизмов внутриклеточной регуляции обмена веществ связано с прекращением действия соответствующих регуляторов и ингибиторов ферментов, изменением под влиянием различных факторов строения и структуры макромолекул ферментов.

Повышение уровня внутриклеточных ферментов в плазме крови прямо зависит от природы повреждающего воздействия, времени действия и степени повреждения биомембран клеток и субклеточных структур органов. В оценке ферментных тестов для диагностических целей особое значение имеет знание периода полужизни (полураспада) в плазме крови каждого из диагностических ферментов, что делает важным выбор точного времени для ферментного анализа крови. Весьма существенным является также знание особенностей распределения ферментов в индивидуальных органах и тканях, а также их внутриклеточной локализации.

Многие факторы, приводящие к развитию воспалительного процесса, способны повышать проницаемость мембран для белков и таким образом вызывать утечку внутриклеточных ферментов. Скорость выхода различных ферментов из поврежденных тканей неодинакова. На этот процесс воздействуют следующие факторы: концентрационный градиент, он неодинаков для различных типов клеток. Так в клетках печени содержание ЛДГ выше в 3 тысячи раз, чем вне клеток: 3000:1, а в эритроцитах этот перепад только в 200 раз внутри выше, чем в сыворотке крови. Установлено, что ферменты с высоким концентрационным градиентом быстрее уходят из клетки, чем ферменты с меньшим градиентом.

Вторым фактором, влияющим на скорость выхода ферментов из клетки, является размер форменных молекул. Более мелкие диффундируют с большей скоростью, чем крупные. И мелкие высвобождаются на ранней стадии повреждения.

Третий фактор – это внутриклеточная локализация ферментов. Легко из тканей высвобождаются ферменты цитоплазмы клетки. Выход митохондриальных ферментов возможен при распаде органелл.

На характер выхода ферментов из поврежденного органа влияет масса пораженного органа. Например, поражение печени обычно приводит к увеличению уровня ферментов в сыворотке крови, тогда как при заболеваниях легких они не обнаруживаются, так как масса их несколько граммов

Природа повреждения – инфекционная, химическая, механическая и другие тоже влияет на характер выхода ферментов. При обратимых воспалительных процессах, при которых происходит увеличение проницаемости мембран, высвобождаются ферменты цитоплазмы и не освобождаются митохондриальные ферменты, а при некротических состояниях разрушение клетки приводит к появлению в сыворотке крови митохондриальных ферментов (глутаматдегидрогеназы, аспартаттрансамилазы и других).

Методы количественной оценки ферментативных реакций сводятся к созданию оптимальных условий для проведения реакции и регистрации изменения концентрации субстрата, продукта или кофермента в реакционной среде. Широко применяются спектрофотометрические, флюориметрические, манометрические, поляриметрические, электродные, цито- и гистохимические методы исследования.

Не нашли то, что искали? Воспользуйтесь поиском:

источник

Изоферменты, их происхождение, биологическое значение. Определение ферментов и изоферментного спектра плазмы крови с целью диагностики болезней.

Ферменты, катализирующие одну и ту же химическую реакцию, но отличающиеся по первичной структуре белка, называют изофермен-тами, или изоэнзимами. Они катализируют один и тот же тип реакции с принципиально одинаковым механизмом, но отличаются друг от друга кинетическими параметрами, условиями активации, особенностями связи апофермента и кофермента. Природа появления изоферментов разнообразна, но чаще всего обусловлена различиями в структуре генов, кодирующих эти изоферменты. Следовательно, изоферменты различаются по первичной структуре белковой молекулы и, соответственно, по физико-химическим свойствам. На различиях в физико-химических свойствах основаны методы определения изоферментов.

По своей структуре изоферменты в основном являются олигомерными белками. Причём та или иная ткань преимущественно синтезирует определённые виды протомеров. В результате определённой комбинации этих протомеров формируются ферменты с различной структурой — изомерные формы. Обнаружение определённых изоферментных форм ферментов позволяет использовать их для диагностики заболеваний.

Фермент лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимую реакцию окисления лактата (молочной кислоты) до пирувата (пировиноградной кислоты). Повышение активности наблюдают при острых поражениях сердца, печени, почек, а также при мегалобластных и гемолитических анемиях. Однако это указывает на повреждение лишь одной из перечисленных тканей.

Креатинкиназа (КК) катализирует реакцию образования креатинфосфата. Определение активности КК в плазме крови имеет диагностическое значение при инфаркте миокарда (происходит повышение уровня МВ-изоформы). Количество изоформы ММ может повышаться при травмах и повреждениях скелетных мышц. Изоформа ВВ не может проникнуть через гематоэнцефалический барьер, поэтому в крови практически не определяется даже при инсультах и диагностического значения не имеет.

10. Органная специфичность изоферментов ЛДГ. Физиологические значения общей активности лактатдегидрогеназы и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности ЛДГ и ее изоферментов.

Лактатдегидрогеназа является гликолитическим ферментом и катализирует следующую реакцию: Лактат + НАД Лактатдегидрогеназа Пируват + НАДН

Молекула ЛДГ представляет собой тетрамер, состоящий из одного или двух типов субъединиц, обозначаемых как M (мышцы) и H (сердце). В сыворотке крови фермент существует в пяти молекулярных формах, различающихся по первичной структуре, кинетическим свойствам, электрофоретической подвижности (ЛДГ‑1 быстрее движется к аноду по сравнению с ЛДГ‑5, то есть более электрофоретичеки подвижна). Каждая форма имеет характерный полипептидный состав: ЛДГ‑1 состоит из 4 H‑субъединиц, ЛДГ‑2 — из 3 H‑субъединиц и 1 M‑субъединицы, ЛДГ‑3 представляет собой тетрамер из 2 H‑субъединиц и 2 M‑субъединиц, ЛДГ‑4 содержит 1 H‑субъединицу и 3 M‑субъединицы, ЛДГ‑5 состоит только из M‑субъединиц. По степени убывания общей каталитической активности энзима все органы и ткани располагаются в следующем порядке: почки, сердце, скелетные мышцы, поджелудочная железа, селезенка, печень, легкие, сыворотка крови.

От того, какой изофермент наиболее представлен, зависит преимущественный способ окисления глюкозы в ткани: аэробный (до CO2 и H2O) или анаэробный (до молочной кислоты). Подобное различие обусловлено разной степенью сродства изоферментов к пировиноградной кислоте. Изоферменты, содержащие в основном H‑субъединицы (ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2), обладают низким сродством к пирувату и поэтому неспособны эффективно конкурировать за субстрат с пируватдегидрогеназным комплексом. В результате пируват подвергается окислительному декарбоксилированию и в виде ацетил‑КоA вступает в цикл Кребса.

Напротив, изоферменты, обладающие главным образом M‑субъединицами (ЛДГ‑4 и ЛДГ‑5), имеют более высокое сродство к пирувату и, как следствие, превращают его в молочную кислоту. Для каждой ткани установлены наиболее типичные изоферменты. Для миокарда и мозговой ткани основным изоэнзимом является ЛДГ‑1, для эритроцитов, тромбоцитов, почечной ткани — ЛДГ‑1 и ЛДГ‑2. В легких, селезенке, щитовидной и поджелудочной железах, надпочечниках, лимфоцитах преобладает ЛДГ‑3. ЛДГ‑4 находится во всех тканях с ЛДГ‑3, а также в гранулоцитах и мужских половых клетках, в последних дополнительно обнаруживается ЛДГ‑5. В скелетных мышцах изоферментная активность располагается в порядке убывания в ряду: ЛДГ‑5, ЛДГ‑4, ЛДГ‑3. Для печени наиболее характерен изофермент ЛДГ‑5, выявляется также ЛДГ‑4.

В норме основным источником активности ЛДГ в плазме крови являются разрушающиеся клетки крови. В сыворотке активность изоферментов распределяется следующим образом: ЛДГ‑2 > ЛДГ‑1 > ЛДГ‑3 > ЛДГ‑4 > ЛДГ‑5. При электрофорезе между фракциями ЛДГ‑3 и ЛДГ‑4 иногда обнаруживается дополнительная полоса изофермента ЛДГ‑X, данный изофермент локализован в тех же органах, что и ЛДГ‑5.

Все заболевания, протекающие с разрушением клеток, сопровождаются резким повышением активности ЛДГ в сыворотке крови. Нарастание общей активности фермента обнаруживается при таких заболеваниях как инфаркт миокарда, некротическое поражение почек, гепатит, панкреатит, воспаление и инфаркт легкого, опухоли различной локализации, повреждения, дистрофия и атрофия мышц, гемолитические анемии и физиологическая желтуха новорожденных, лимфогранулематоз, лейкозы. При инфаркте миокарда начало роста активности фермента в сыворотке крови отмечается на 8‑10 час от момента приступа, максимальное увеличение наступает к 24‑48 часу, нередко в 15‑20 раз превышая норму. Повышенная активность ЛДГ сохраняется до 10‑12 суток от начала заболевания. Степень нарастания активности фермента не всегда коррелирует с размерами поражения сердечной мышцы и для прогноза исхода заболевания может являться лишь ориентировочным фактором. У больных стенокардией активность фермента не изменяется, что позволяет применять тест для дифференциальной диагностики в пределах 2‑3 суток после сердечного приступа. Наличие органной специфичности ферментов позволяет применять исследование их активности с целью топической диагностики.

11. Физиологические значения общей активности креатининкиназы (КК) и ее изоферментов в плазме крови. Диагностическая значимость определения активности КК и ее изоферментов.

Креатинкиназа (КК) – это фермент, природный катализатор химических реакций, значительно увеличивающий скорость преобразования креатина и АТФ (аденозинтрифосфат) в высокоэнергетическое соединение креатинфосфат, который расходуется при интенсивных мышечных сокращениях. Данный фермент содержится в цитоплазме клеток различных мышц (сердечной, скелетных), а также в клетках мозга, легких, щитовидной железы.

Молекулу креатинкиназы можно поделить на две части, каждая из которых реализуется в виде отдельной субъединицы: М (мышца), и B (мозг). Данные субъединицы в организме человека могут объединяться вместе тремя способами, образуя, соответственно, три изоформы креатинкиназы: ММ, МВ и ВВ. Эти изоферменты отличаются своей локализацией в организме человека: креатинкиназа ММ расположена в миокарде и скелетных мышцах; креатинкиназа МВ локализована в большей степени в миокарде; креатинкиназа ВВ содержится в клетках плаценты, головного мозга, мочевыводящих путей, некоторых опухолях и других местах.

Нормальная концентрация фермента напрямую зависит от возраста и пола человека. В связи с активным развитием мускулатуры и нервной системы, у детей активность природного катализатора повышена по отношению к активности у взрослых. У женщин креатинкиназа ниже, чем у мужчин.

Уровень изофермента ММ оказывается повышен в большей степени в результате повреждений мышц, и редко при повреждениях сердца. Содержание КК МВ связано с повреждением миокарда. Значительное увеличение активности данной формы наблюдается при инфаркте миокарда. Ее уровень резко возрастает уже через два — четыре часа после первых симптомов. Поэтому концентрация данного фермента в крови активно используется для определения инфаркта миокарда. Однако, стоит отметить, что содержание КК МВ возвращается к нормальному уровню по прошествии трех-шести дней, что обуславливает низкую эффективность диагностики на поздних сроках. Концентрация КК ВВ увеличивается при онкологических заболеваниях. Снижение уровня изоферментов не несет никакой диагностической ценности, так как минимальный порог содержания КК у здорового человека равен нулю.

12. Липазы плазмы крови. Диагностическая значимость определения активности липазы.Липаза — синтезируемый человеческим организмом водорастворимый фермент, катализирующий гидролиз нерастворимых эстеров (липидных субстратов) и способствующий перевариванию, растворению и фракционированию нейтральных жиров. Вместе с желчью липаза стимулирует переваривание жиров, жирных кислот, жирорастворимых витаминов А, Е, D, К, трансформируя их в энергию и тепло. Назначением липопротеинлипазы является расщепление триглицеридов (липидов) в липопротеинах крови, благодаря чему обеспечивается доставка жирных кислот к тканям. Липазу вырабатывают: поджелудочная железа; печень; легкие; кишечник особые железы, расположенные в ротовой полости детей грудного возраста. В последнем случае синтезируется так называемая лингвальная липаза. Каждый из перечисленных ферментов способствует расщеплению определенной группы жиров.

С точки зрения значимости при постановке диагноза важную роль играет липаза, вырабатываемая поджелудочной железой. Повышение уровня фермента отмечается при: панкреатите, протекающем в острой форме, или при обострении хронического процесса; желчных коликах; травме поджелудочной железы; наличии в поджелудочной железе новообразований; хронических патологиях желчного пузыря; образовании кисты или псевдокисты в поджелудочной железе; закупорке панкреатического протока рубцом или камнем; внутрипеченочном холестазе; острой кишечной непроходимости; инфаркте кишечника; перитоните; прободении язвы желудка; перфорации внутреннего (полого) органа; острой или хронической почечной патологии; эпидемическом паротите, при котором происходит поражение поджелудочной железы; нарушениях обменных процессов, имеющих место при сахарном диабете, ожирении или подагре; циррозе печени; длительном приеме медицинских препаратов – в частности, барбитуратов, анальгетиков наркотического ряда, гепарина, индометацина; операции по трансплантации органов. В редких случаях процесс активизации липазы оказывается связанным с некоторыми травмами – например, переломами трубчатых костей. Но в этом случае колебания уровня фермента в крови не могут считаться специфическим показателем наличия физического повреждения. По этой причине анализы на липазу не учитываются при диагностике травм различного происхождения.

Определение уровня липазы в сыворотке обретает особую важность при любом поражении поджелудочной железы. В этом случае анализ крови на содержание данного энзима вместе с анализом на амилазу (фермент, способствующий расщеплению крахмала до олигосахаридов) с высокой степенью достоверности указывает на наличие патологического процесса в тканях поджелудочной железы: оба показателя оказываются выше нормы). В процессе нормализации состояния больного названные ферменты возвращаются к адекватным показателям не одновременно: как правило, уровень липазы остается на высоком уровне дольше, чем уровень амилазы.

Высокий уровень липазы сохраняется от 3 до 7 суток с начала развития воспаления. Тенденция к снижению фиксируется только спустя 7-14 дней.

Низкий уровень липазы фиксируется: при наличии злокачественного новообразования в любой части организма, кроме самой поджелудочной железы; вследствие снижения функции поджелудочной железы; при кистозном фиброзе (муковисцидозе) – генетическом заболевании с тяжелым течением, возникающем в результате патологического поражения желез внешней секреции (ЖКТ, легких). после оперативного вмешательства по удалению поджелудочной железы; при избыточном содержании триглицеридов в крови, возникающем по причине неправильного питания с обилием жирных продуктов в рационе или вследствие наследственной гиперлипидемии. В некоторых случаях снижение уровня липазы является маркером перехода панкреатита в хроническую форму.

Последнее изменение этой страницы: 2017-01-27; Нарушение авторского права страницы

источник

Активность изоферментов ЛДГ в сыворотке крови в порядке убывания: ЛДГ₂ > ЛДГ₁ > ЛДГ₃ > ЛДГ₄ > ЛДГ₅.

Изоферменты ЛДГ в лейкоцитах в норме: ЛДГ₃ > ЛДГ₂, > ЛДГ₄ > ЛДГ₁ > ЛДГ₅.

Инфаркт миокарда: ↑↑↑ ЛДГ₁, ↑ ЛДГ₂. ЛДГ₁/ЛДГ₂ > 1. Изменения в активности изоферментов сохраняются дольше, чем суммарной активности фермента. При неясной клинической картине и нормальной общей активности ЛДГ повышение активности ЛДГ₁ указывает на мелкие некротические очаги в миокарде, не регистрируемые другими способами.

Мышечные дистрофии: в мышечной ткани ↓↓ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (степень снижения коррелирует с тяжестью заболевания), ↑↑ ЛДГ₁, ЛДГ₂, и ЛДГ₃. В сыворотке крови ↑↑ ЛДГ₁, ЛДГ₂ и ЛДГ₃.

Диагностическое значение изоферментов ЛДГ

Острый лейкоз: ↑↑↑ ЛДГ₂, ↑ЛДГ₃ . Прямо пропорциональная зависимость между увеличением ЛДГ₂ и количеством незрелых клеток.

Опухолевые заболевания: ↑↑ ЛДГ₃ ЛДГ₄ и ЛДГ₅ в опухолевой (приближение к эмбриональному типу). Различия между злокачественными и доброкачественными максимальны по ЛДГ₅. Степень изменения спектра изоферментов коррелирует с ростом опухоли.

Заболевания легких: ↑↑ ЛДГ₃ при пневмониях. При выраженной гипоксии ↑ЛДГ₄ и ЛДГ₅ (активация гликолиза в связи с перестройкой метаболизма на анаэробный тип).

50. Креатинкиназа (КК), методы определения, клинико-диагностическое значение .

КК катализирует обратимую реакцию образования креатинфосфата из креатина и АТФ. Креатинфосфат является макроэргическим фосфатом, используемым мышцами для сокращения, расслабления и транспортировки метаболитов. Молекулы КК имеют свои особенности распределения в организме. Существуют три активных изофермента КК: мышечный изоэнзим-КК-ММ, сердечный изоэнзим-КК-МВ, мозговой изоэнзим-КК-ВВ.

Метод определения: При определении активности креатинкиназы-MB используется модифицированный метод Вурцберга и др.

Активность фермента измеряется в присутствии антител к мономеру креатинкиназы-M, которые полностью ингибируют креатинкиназу-MM, но не влияют на активность В-субъединиц креатинкиназы-MB и креатинкиназы-BB.

Установлено, что в сыворотке крови здоровых людей активность ММ-изофермента составляет около 95% общей активности КК, и около 5% приходится на активность КК-МВ. При остром инфаркте миокарда спустя 4—6 ч после развития очага повышается активность КК. Максимум активности КК выявляется в течение 12—36 ч, увеличение активности происходит в основном в результате подъема активности КК-МВ.

Клинико-диагностическое значение

Активность общей креатинкиназы повышается при многих заболеваниях: инфаркте миокарда, сахарном диабете, гипотиреозе, мышечных травмах, а также после внутримышечных инъекций, больших физических нагрузок, при дигитализации, хирургических вмешательствах, при мышечных дистрофиях всех типов, инфекционных болезнях, дефибрилляции, застойной сердечной недостаточности, тахикардии, эмболии легочной артерии, генерализованных судорогах, обширном инфаркте мозга, беременности, опухолях предстательной железы, мочевого пузыря, желудочно-кишечного тракта, отеке легкого, остром психозе, травмах головы, инфарктах желудочно-кишечного тракта. Среди пациентов кардиологического отделения подъем активности КК имеет чувствительность 97%, специфичность 67% для инфаркта миокарда.

51. Амилаза и липаза, методы определения, клинико-диагностическое значение. Макроамилаземия. Амилазо-креатининовый индекс.

Амилаза сыворотки и мочи

Гидролазы, катализирующие гидролиз полисахаридов. В плазме амилаза двух изоэнзимных типов — панкреатическая – Р-тип (составляет 40%) и слюнная – S-тип (60%). С мочой выделяется в основном Р-тип.

Норма в сыворотке 16-30 г/чхл, в моче – до 160 г/чхл.

Методы определения могут быть разделены на 3 основные группы: амилокластические, классические «сахарогенные», включая методы с использованием сопряженных ферментативных реакций, и хромогенные, основанные на применении синтетических комплексов крахмал–краситель или 4-нитрофенил-гликозидов .

1. Методы, основанные на использовании крахмала

1.1. Амилокластические методы.

Трудности при использовании крахмала в качестве субстрата связаны с тем, что образцы крахмала значительно отличаются по многим параметрам, в частности по соотношению амилозы и амилопектина. Длина цепи молекулы крахмала зависит от способа его получения и метода приготовления раствора субстрата. Крахмал нерастворим в воде. При приготовлении субстрата он образует коллоидный раствор, содержащий гидратированные мицеллы различного размера. Степень дисперсности меняется в зависимости от температуры; при более низких температурах образуются более крупные мицеллы. Наиболее часто используют картофельный и кукурузный крахмал. В этих методах активность амилазы определяют по уменьшению концентрации субстрата реакции — крахмала. Йодометрические методы оказались наиболее популярными. В ставшем классическим йодометрическом методе Вольгемута ряд последовательных разведений исследуемого образца инкубируют с крахмалом и определяют то разведение исходного материала, которое обеспечивает полный гидролиз крахмала в течение определенного промежутка времени. В других популярных вариантах амилокластического метода скорость реакции оценивали по количеству крахмала, расщепленного в ходе инкубации. Избыток крахмала определяли по изменению поглощения комплекса йод–крахмал.

1. 2. Турбидиметрические и нефелометрические методы

Турбидиметрические методы основаны на способности амилазы снижать мутность суспензии субстрата в результате ферментативной деградации молекулы субстрата [18]. Использование лазерной нефелометрии привело к повышению аналитической чувствительности и точности по сравнению с обычными нефелометрами [19]. Турбидиметрические и светорассеивающие методы выполняют путем непрерывной регистрации или фиксированного времени. Эти методы сложно стандартизировать из-за различий в свойствах субстрата.

Вискозиметрические методы. Основаны на изменении вязкости инкубационной среды в ходе гидролиза крахмала амилазой. В настоящее время не используются.

1.3. Редуктометрические методы

Образец и субстрат инкубируют в течение 30 мин; и в контроле, и в образце определяют редуцирующие соединения. Поскольку конечные продукты реакции амилазы являются редуцирующими соединениями, активность фермента пропорциональна количеству редуцирующих соединений. Для их определения использовали известные в то время методические приемы: восстановление пикрата (Lewis и Bentdict), феррицианида (Haggedorn–Jensen), а также методы, основанные на взаимодействии антрона с углеводами. Количество образовавшихся в ходе реакции редуцирующих сахаров определяли после осаждения белков осадителями, способными дополнительно удалять из раствора ряд компонентов, обладающих редуцирующими свойствами.

Результаты выражали в мг редуцирующих веществ и относили редуцирующую способность к содержанию глюкозы. За единицу активности Somogyi принимали активность амилазы, способную в ходе 30-минутной инкубации при 40 °С и рН 7,0 высвобождать количество редуцирующих веществ, эквивалентное 1 мг глюкозы.

2. Методы, основанные на использовании хромогенных субстратов

В них используют в качестве субстрата олиго- и полисахариды, меченые различными хромогенными группами, высвобождающимися под действием амилазы. Амилаза сыворотки крови гидролизует α-1,4-связи и отщепляет небольшие фрагменты исходной молекулы, связанные с индикаторными группами. Их количество определяют с помощью фотометрических методов после отделения непрореагировавшего субстрата центрифугированием или фильтрацией. Эти методы были популярны в свое время, т. к. они более удобны по сравнению с трудоемкими сахарогенными и амилокластическими методами. Примерами могут служить Amylochrome (Roche Diagnostic System) и Phadebas (Pharmacia Diagnostic).

В технологии «сухой» химии в качестве субстрата компания Kodac ECTACHEM использовала амилопектин, ковалентно связанный с красителем Dimarene Red Z2B.

2.1. Методы, использующие субстраты с определенной структурой

Использование субстратов амилазы с определенной структурой, а также вспомогательных и индикаторных ферментов улучшило стехиометрию реакции и привело к контролируемым условиям гидролиза субстрата при определении активности амилазы.

Оказалось, что гидролиз амилазой небольших по размерам олигосахаридов приводит к появлению продуктов реакции с более определенной структурой по сравнению с продуктами гидролиза крахмала. Из многих олигосахаридов наиболее удобными субстратами для определения активности α-амилазы оказались мальтопентоза и мальтотетроза, в связи с их высокой стабильностью, постоянными продуктами гидролиза и однозначной стехиометрией реакции.

2.2. Методы, использующие в качестве субстратов 4-нитрофенил-гликозиды

Субстраты синтезируют путем присоединения 4-НФ к редуцирующему концу определенного олигогликозида. Если олигосахарид — мальтогептоза (Г7), то субстрат — 4-НФ-Г7. Амилаза расщепляет данный субстрат с образованием свободных олигосахаридов (Г5, Г4, Г3) и 4-НФ-Г2 (9%), 4-НФ-Г3 (31%) и 4-НФ-Г4 (60%). Примечательно, что в значительных количествах не образуются Г6, Г1, 4-НФ-Г6 и 4-НФ-Г5. При добавлении a-глюкозидазы происходит гидролиз 4-НФ-Г4 до 4-НФ и олигосахарида; 4-НФ-Г3 и 4-НФ-Г2 гидролизуются до свободного 4-НФ и глюкозы.

Панкреатический изофермент гидролизует субстрат с большей скоростью, чем слюнный изофермент, в соотношении 1,8 : 1.

Совместное действие амилазы и α-глюкозидазы на субстрат приводит к тому, что более 30% продуктов реакции составляет свободный НФ. Свободный НФ обнаруживают по поглощению при 405 нм. Фермент α-глиюкозидаза не действует на олигосахариды, содержащие больше 4 молекул глюкозы в цепи; Г4 гидролизуется чрезвычайно медленно.

Данная группа методов основана на отщеплении при участии амилазы окрашенного красителя от субстрата-крахмала. Высвободившийся краситель диффундирует в поверхностный слой, где величина отражения определяется фотометрически. Непрореагировавший субстрат остается в реакционном слое и скрыт от фотометрии.

При использовании технологии «сухой» химии сыворотка или гепаринизированная плазма крови может использоваться в качестве образца [26]. В то же время в одном из исследований было показано, что в образцах гепаринизированной плазмы выявлялись значительно более высокие результаты, чем в образце сыворотки крови [27]. Связан ли этот эффект с уникальными свойствами технологии «сухой» химии и насколько гепарин влияет на результаты определения активности амилазы в системах «dry chemistry» — неизвестно.

За исключением гепарина, все антикоагулянты ингибируют активность амилазы, поскольку способны связывать ионы Ca2+. Соли лимонной кислоты, ЭДТУК и оксалат ингибируют активность на 15%. В связи с этим для определения АМИ следует использовать сыворотку или гепаринизированную плазму крови. Фермент весьма устойчив, его активность не меняется при хранении в течение 4 дней при комнатной температуре, 2 недель — при +4 °C, 1 года — при –25 °C и 5 лет — при –75 °C [28].

Дата добавления: 2017-01-28 ; просмотров: 1785 | Нарушение авторских прав

источник