Меню Рубрики

Рпга анализ крови расшифровка коклюш

Определение в крови иммунных антител к коклюшной палочке используют для диагностирования коклюша и оценивания напряженности иммунитета после вакцинации.

При лабораторном методе РПГА ( реакции пассивной гемагглютинации) серолог готовит в лунках лабораторных планшеток последовательное разведение исследуемых проб (1:10, 1:20) и добавляет к образцам коклюшный диагностикум (стандартные эритроциты, нагруженные антигеном возбудителя) и оставляют на 120 минут в термостате. Считывают результат по оцениванию внешнего вида осадка: при позитивном результате (наличии антител к патогену) эритроциты слипаются и образуют «перевернутый зонтик», при негативном — «пуговку».

Сроки выполнения 7-10 дней
Синонимы (rus) Специфические антитела к палочке коклюша
Cинонимы (eng) Total antibodies to Bordetella pertussis
Методы анализа
Полуколичественная реакция пассивной гемагглютинации
Подготовка к исследованию Анализ проводится утром, натощак.
С последнего приема пищи должно пройти не менее 8 часов.
Запрещены спиртные напитки (не менее чем за 24 часа до взятия биоматериала).
Не рекомендуется сдавать кровь на серологию после флюорографии, рентгена, физиотерапевтических процедур.
Тип биоматериала и способы его взятия Кровь, отбор производят из вены в лечебном учреждении.

Коклюшем называют острую бактериальную инфекцию, характеризующуюся приступами спазматического кашля. Это опасное воздушно-капельное заболевание вызывает антропонозная (способная поражать только человеческий организм) бактерия Bordetella pertussis или Борде-Жангу, названная в честь ученых, описавших ее впервые.

Наиболее часто инфекция поражает дошкольников, около 50% случаев — это дети двухлетнего возраста. Инфицирование происходит при контакте с больным человеком или вирус-носителем.

Инфекционный процесс коклюша характеризуют четыре стадии течения:

  • продромальная;
  • катаральная;
  • пароксизмальная;
  • реконвалесценции (выздоровления).

Чаще всего к специалисту пациенты обращаются в пароксизмальном периоде — при наличии характерных клинических проявлений инфекции: спастического кашля до рвоты и синюшных кожных покровов лица.

Ведущая роль в диагностировании коклюша принадлежит серологическим методам — выявлении иммунных антител. Одной из наиболее используемых методик является реакция пассивной гемагглютинации (РПГА), ее точность и информативность намного превосходит бактериологический метод.

«Негативный результат» означает:

  • инфицирования бактерией Bordetella pertussis нет;
  • неэффективность АКДС-вакцины;
  • угасание гуморального ответа после проведенной ранее вакцинации.

Диагностическим считается титр 1:100 — «положительный результат». Свидетельствует о пароксизмальной стадии коклюша и специфическом гуморальном ответе.

Рекомендации:
Проведение метода РПГА не следует использовать для диагностирования коклюша у детей до 1 года, пожилых людей и больных с иммунодепрессией (угнетением иммунитета).

Стоимость анализов Вопрос: Здравствуйте! Просьба, написать стоимость следующих анализов. Планирую сдавать в г.Сочи Старонасыпная ул., 22, микрорайон Адлер, БЦ Офис Плаза, эт. 2 Для женщины: 1.УЗИ органов малого таза на 5-8 день менструального цикла. 2.Определение группы крови( в том числе и резус фактора). 3.Клинический анализ крови, включая свертываемость крови 4.Биохимический анализ крови (в т.ч. глюкоза, общий белок, прямой и непрямой билирубин, мочевина) 5.Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С 6.Коагулограмма (по показаниям) 7.Общий анализ мочи 8.Исследование состояния матки и маточных труб (лапароскопия, гистеросальпингография или гистеросальпингоскопия) — по показаниям. 9.Инфекционное обследование: — бактериологическое исследование отделяемого влагалища, цервикального канала из уретры (мазок на флору) — микроскопическое исследование отделяемого цервикального канала на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, трихомонады, грибы рода Candida (посев из цервикального канала) — ПЦР (хламидии, уреа- и микоплазмы, вирус простого герпеса I-II типов, цитомегаловирус) (цервикальный канал) — определение антител класса М, G на токсоплазму, краснуху (кровь) 10.ЭКГ 11.Флюорография легких (действительна 12 месяцев). 12.Консультация терапевта 13.Кольпоскопия и цитологическое исследование шейки матки . 14.Маммография (женщинам старше 35 лет), УЗИ молочных желез (женщинам до 35 лет). 15.Хромосомный анализ супружеским парам старше 35 лет, женщинам, имеющим в анамнезе случаи врожденных пороков развития и хромосомных болезней, в том числе и у близких родственников; женщинам, страдающим первичной аменореей. 16.Гистероскопия и биопсия эндометрия (по показаниям). 17.Гормональное обследование: кровь на 2-5 дни менструального цикла: ЛГ, ФСГ, пролактин, тестостерон (св., общ.), эстрадиол, прогестерон, кортизол (800-1700), Т3 св, Т4 св, ТТГ, СТГ, АМГ , 17-ОП, ДГА-S . кровь на 20-22 день цикла: прогестерон. 18. Консультация эндокринолога(по показаниям). 19. Заключение профильных специалистов при наличии экстрагенитальной патологии (по показаниям). 20.УЗИ щитовидной железы и паращитовидных желез, почек и надпочечников (по показаниям). Для мужчины: 1.Анализ крови на сифилис, ВИЧ, гепатиты В и С (анализы действительны 3 месяца). 2. Спермограмма и МАР-тест 3. Микроскопическое исследование эякулята на аэробные и факультативно-анаэробные микроорганизмы, трихомонады, грибы рода Candida (посев эякулята) (анализы действительны 6 месяцев). 4.ПЦР (хламидии, уреа- и микоплазмы, вирус простого герпеса I-II типов, цитомегаловирус) (эякулят). 5.Консультация андролога/уролога .

источник

Современная диагностика коклюша позволяет быстро поставить правильный диагноз и назначить адекватное лечение, что позволяет значительно облегчить состояние больного и провести своевременные профилактические мероприятия, предотвратив заражение окружающих и контактных лиц. Анализ на коклюш с применением бактериологического метода исследования является основным в диагностике заболевания.

Однако опыт многих исследований доказывает, что для точной лабораторной диагностики заболевания необходимо использовать несколько взаимодополняющих методик. Наиболее эффективная комбинация — сочетание бактериологического метода и полимеразной цепной реакции (ПЦР).

Рис. 1. Спазматический приступообразный кашель — доминирующий симптомом коклюша у детей.

Распознавание коклюша на ранних этапах развития заболевания претерпевает большие трудности, что связано с несколькими факторами:

  • Болезнь развивается медленно. Ее кульминация приходится на 2 — 3 неделю после возникновения первых симптомов заболевания.
  • Первичный токсикоз и выраженная температурная реакция вначале заболевания, так характерные для многих детских инфекционных заболеваний, при коклюше отсутствуют. Поэтому часто лабораторная диагностика запаздывает.
  • У привитых детей и взрослых чаще всего регистрируются атипичные формы заболевания, при которых меняется характеристика кашля (отсутствуют приступы спазматического кашля и репризы).

Критерии постановки диагноза коклюша в предсудорожный (катаральный) период:

  • Контакт с больными, у которых отмечается длительный кашель.
  • Медленное развитие заболевания. Нормальная или небольшая температура тела. Удовлетворительное состояние больного.
  • Отсутствие выраженных катаральных явлений.
  • Вначале покашливание, а потом упорный сухой кашель до перехода в приступообразный спазматический кашель длится 1 — 2 недели.
  • Эффект от симптоматической терапии отсутствует.
  • Хрипы в легких часто не выслушиваются. Высокое содержание лейкоцитов (лейкоцитоз) и лимфоцитов (лимфоцитоз) при нормальной скорости оседания эритроцитов (СОЭ).
  • Обнаружение в посевах возбудителей коклюша ( ).

Рис. 2. На фото бактерии Bordetella pertussis розового цвета под микроскопом (окраска по Граму). Коклюшные палочки короткие, коковидной формы, концы закруглены, длина составляет 0,5 — 2 мкм, в мазках располагаются отдельно, реже — попарно.

Рис. 3. Вид бактерий коклюша в электронный микроскоп.

Выделение возбудителей коклюша из носоглоточной слизи — классический метод лабораторного подтверждения заболевания. Высеваемость возбудителей редко достигает 80%. В среднем он не превышает 10 — 30%. Причиной этому являются:

  • Медленный рост коклюшных палочек на питательных средах.
  • Низкое качество питательных сред.
  • Позднее обследование больного.
  • Загрязнение исследуемого материала бактериальной флорой.
  • Погрешности при заборе исследуемого материала.
  • Применение антибиотиков до момента забора материала для бактериологического исследования.

Материалом для бактериологического исследования служит мазок из носовых ходов (обеих) и задней стенки носоглотки (не из гортани!).

Для взятия мазка применяется тампон из дакрона или используется метод «кашлевых пластинок».

Посев производится сразу на питательную или транспортную среды. На транспортной среде материал хранится не более одних суток. Предварительный ответ получается на 3 — 5 сутки. Окончательный ответ получается на 5 — 7 сутки.

Обследованию подлежат лица с подозрением на заболевание и лица, кашель у которых сохраняется более 7-и, но не более 30-и дней.

Рис. 4. На фото колонии Bordetella pertussis. Для культивирования используется среда Борде-Жангу (фото справа) или казеиново-угольный агар (фото слева). На этих средах формирование колоний происходит на 3 — 4 день после посева. Колонии микробов блестящие, серовато-кремовой окраски, напоминают по внешнему виду капельки ртути, имеют вязкую консистенцию. После снятия колоний с питательной среды остается сметанообразный след.

Рис. 5. При просмотре колоний Bordetella pertussis в световом микроскопе можно видеть, как колонии отбрасывают тень (световой конус).

Диагностика коклюша с применением ПЦР (полимеразной цепной реакции) является самой перспективной методикой в современных условиях. Высокая чувствительность теста позволяет выявлять ДНК бактерий, даже если в исследуемом материале их несколько десятков.

Методика определения ДНК с помощью ПЦР была разработана в Новосибирске в 1999 году. Она имеет целый ряд преимуществ перед бактериологическим методом:

  • Высокая чувствительность данного метода. Даже наличие одного или нескольких возбудителей в пробе позволяет получить положительный результат.
  • Данный метод является высокоспецифичным. Удельный вес положительных результатов составляет 85 — 100%. Загрязнение вторичной микрофлорой не влияет на результат исследования.
  • Результат получается в течение 1-го дня.

Данный метод диагностики не заменяет культуральный метод.

Бактериологический метод и методика ПЦР являются взаимодополняющими и достоверными тестами при выявлении Bordetella pertussis.

Рис. 6. На фото виды колоний Bordetella pertussis.

Низкий удельный вес бактериологического подтверждения заболевания стал толчком к разработке других, более чувствительных методов идентификации возбудителя коклюша. В 60-е годы появился метод определения с помощью флюоресцирующих антител. Специально обработанные мазки просматриваются в флюоресцентный микроскоп. К проведению данного теста допускается только высококвалифицированный персонал, используются качественные реагенты. В противном случае возможно большое количество ложноположительных результатов. Данная методика в практической медицине используется редко.

Рис. 7. Специально обработанные мазки просматриваются в флюоресцентный микроскоп.

Возбудители коклюша содержат вещества (антигены), способные вызвать иммунный ответ в организме инфицированного человека (образование антител). Благодаря серологическим исследованиям выявляются и изучаются антитела и антигены в сыворотке крови больного. В их основе лежат иммунные реакции организма. Специфичность данного вида исследования не достигает 100%, поэтому результаты серологического исследования оцениваются только с учетом клинической картины заболевания. Серологические методы используются так же для проведения эпидемиологического анализа.

Для диагностики коклюша используется несколько тестов:

  • Иммуноферментный анализ (ИФА) — чувствительный, специфичный и относительно недорогой тест. Для его проведения используются белковые антигены бактерий коклюша, с помощью которых измеряются сывороточные иммуноглобулины классов G, M и A, уровень которых повышаются в крови после перенесенного заболевания или проведения иммунизации. Сывороточные иммуноглобулины M повышаются в ранние сроки заболевания, сывороточные иммуноглобулины G — в более поздние сроки.
  • Диагностика коклюша на поздних сроках заболевания осуществляется с помощью реакций агглютинации: РПГА, РНГА и РА. В основе таких реакций лежит способность корпускулярных антигенов склеиваться с помощью антител.

Экспресс-методы лабораторной диагностики коклюша позволяют за несколько минут определить антигены в слизи задней стенки глотки.

При использовании реакции непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) врач может получить результаты через 2 — 6 часов.

При использовании метода латексной микроагглютинации (ЛМА) антигены коклюшных бактерий выявляются через 30 — 40 минут.

Применение методов экспресс-диагностики увеличивают в несколько раз удельный вес лабораторно подтвержденных случаев заболевания.

Изменения клеточного состава крови: высокое содержание лейкоцитов (лейкоцитоз) и лимфоцитов (лимфоцитоз) при нормальной скорости оседания эритроцитов (СОЭ) чаще выявляются у невакцинированных детей.

В какой бы форме не протекал коклюш, сегодня врачи имеют возможность в ранние сроки провести лабораторную диагностику этого заболевания.

Рис. 8. На фото слева лейкоциты, справа — лимфоциты. При коклюше их количество значительно увеличивается.

Метод дифференциальной диагностики позволяет исключить целый ряд возможных заболеваний у больных и установить единственно правильный диагноз. Правильно проведенная дифференциальная диагностика коклюша позволяет своевременно назначить больному адекватное лечение, тем самым облегчив течение заболевания.

Коклюш следует дифференцировать от ОРВИ, паракоклюша, бронхита, бронхиальной астмы, наличия инородных тел в дыхательных путях, пневмоний, туберкулезного бронхоаденита и др.

  • Самые большие трудности представляет диагностика заболевания в катаральном периоде . Коклюш в этот период имеет много сходных черт с целой группой острых респираторных вирусных заболеваний, а так же с корью и паракоклюшем. Для коклюша в этот период характерен упорный, нарастающий кашель и отсутствие или слабая выраженность катаральных явлений верхних дыхательных путей. В этот период необходимо применять экспресс-методики и бактериологическую диагностику коклюша.
  • В период приступов спазматического кашля коклюш следует различать от острых респираторных заболеваний с обструктивным синдромом, острых вирусных заболеваний с преимущественным поражением нижних отделов респираторного аппарата, респираторного микоплазмоза, туберкулезного бронхоаденита, аспирации инородного тела, опухоли средостения, бронхолегочной формой муковисцидоза.

Характерные приступы судорожного кашля с протяжными выдохами не всегда присутствуют у детей, получивших прививки, например, АКДС. Поэтому врачи и родители рассчитывают, что анализ на коклюш расставит все точки над «и». Заразная болезнь особенно тяжело протекает у детей первого года жизни. Инкубационный период составляет в среднем 1–2 недели, начальные симптомы напоминают ОРВИ.

Род Bordetella объединяет 9 видов бактерий, из которых сильными патогенными свойствами обладают B. pertussis и B. parapertussis — соответственно возбудитель коклюша и паракоклюша (коклюшеподобной инфекции). Это грамотрицательные, аэробные коккобациллы. Патогенные свойства B. pertussis связаны с выделением коклюшного токсина белковой природы. Токсичные вещества бактерий в инактивированной форме включают в состав коклюшных вакцин.

Оптимальная температура выращивания культуры бордетеллы при бактериологическом посеве составляет 35°C. Возбудитель коклюша размножается на специальной среде картофельно-глицеринового либо казеиново-угольного агара. Через несколько дней возникают колонии, имеющие выпуклую форму, с серебристой поверхностью. По мере хранения выделенных штаммов проявляется изменчивость, прежде всего, меняются иммуногенные свойства возбудителя.

Перед тем, как сдавать анализ на коклюш, необходимо учесть, что симптомы интоксикации не проявляются сразу же после заражения. Затем усиливается ночью и по утрам приступообразный кашель. Лицо больного ребенка краснеет, периодически возникают характерные для коклюша вдохи. Завершается такой приступ отхождением вязкой мокроты либо рвотой.

Периодичность течения заболевания

Названия периода Продолжительность Признаки и симптомы
Инкубационный От дней до 14 суток (в среднем — одна неделя)
Предсудорожный От трех дней до двух недель Сухой навязчивый кашель. Температура нормальная
Судорожный От двух недель до двух месяцев и более Характерные шумные вдохи во время судорожного кашля. Отхождение мокроты или рвота после приступа
Обратное развитие От двух недель до двух месяцев Кашель становится редким. Самочувствие ребенка улучшается
Поздняя реконвалесценция
(выздоровление)
От двух до шести месяцев Приступообразный кашель возникает только при нагрузках, волнении, других заболеваниях

Лабораторный посев и ПЦР-исследование обычно назначают в предсудорожном периоде, когда еще нет специфических вдохов при кашле. Учитываются при этом такие диагностические признаки коклюша, как непосредственные контакты с больным человеком в детском саду, школе или семье. Врач, направляя ребенка на бактериологический посев и ПЦР, также смотрит на результаты общего анализа крови.

Врачи выбирают алгоритм исследования в зависимости от возраста маленького пациента, длительности проявления симптомов заболевания, вакцинального статуса. Основной метод лабораторной диагностики — бактериологический анализ на коклюш и паракоклюш. Флюорографию назначают для исключения заболевания с похожими симптомами (острый бронхит, воспаление легких, плеврит).

Специалист в первую очередь обращает внимание на клиническую картину при осмотре ребенка, опрашивает родителей. Врач назначает исследования, способные подтвердить диагноз, при отсутствии явных симптомов заболевания. Ценный материал для педиатра дает результат анализа на коклюш в «Инвитро» (диагностическом центре). Высокий уровень лабораторной диагностики позволят определить степень тяжести заболевания, выявить осложнения инфекции.

От правильного определения примерного срока инфицирования зависит выбор специалистами лабораторных тестов.

Какие анализы сдавать для диагностики возбудителя коклюша и паракоклюшной инфекции

  1. Мазок из глотки — позволяет выделить культуру бактерий с помощью микробиологического посева.
  2. Иммуноферментный анализ крови — метод ИФА для определения антигенов и антител.
  3. Полимеразная цепная реакция — тест ПЦР для выделения ДНК возбудителя.

Примерная схема лабораторной диагностики коклюша и паракоклюша

Методы 1–2 недели от начала заболевания 3–4 недели Свыше 4 недель
Категории Без лечения антибиотиком На фоне антибиотика Без лечения антибиотиком На фоне антибиотика Без лечения/с лечением
Непривитые
дети до 1 года
Бак. посев, метод ПЦР ПЦР Бак. посев, метод ПЦР ПЦР, серология Серология
Непривитые дети старше 1 года Бак. посев, метод ПЦР ПЦР ПЦР, серология,
бак. посев
Серология Серология
Привитые дети, подростки Метод ПЦР, бак. посев ПЦР ПЦР, серология Серология Серология

Получение результата бактериального посева занимает несколько дней. Между тем, экспресс-тест ПЦР дает возможность расшифровать диагноз спустя всего несколько часов. Информативность вышеперечисленных методов диагностики выше у невакцинированных детей. После четырех недель прямые тесты уже не столь эффективны для выделения и определения возбудителя коклюша. Серология позволяет уточнить картину в поздние периоды заболевания даже у ранее вакцинированных детей.

Медперсонал берет мазок у детей с задней стенки глотки, далее высевает на питательную смесь в специальных лабораторных емкостях, где происходит развитие микробов в течение нескольких дней. Готовый материал тщательно изучается под микроскопом, чтобы выделить колонии B. pertussis или B. parapertussis. Бактериологическое исследование рассчитано на то, что в начале заболевания бактерии находятся в глотке и носовой полости.

Бактериологический посев считается «золотым стандартом» диагностики коклюшной инфекции у детей.

Микробиологический посев с последующим микроскопическим исследованием при коклюше позволяет диагностировать либо исключить инфекцию. Если результаты анализа положительные, то необходимо начать адекватное лечение и профилактику осложнений. Однако бактериологическое исследование малодостоверно на фоне терапии антибактериальными средствами.

Забор материала тампоном из глотки доставляет незначительный дискомфорт взрослому, но малыши обычно сопротивляются и капризничают. Для такого случая предусмотрен вариант забора слизи для исследования из носа. Перед тем, как сдать анализ, рекомендуется не полоскать горло, не чистить зубы, не закапывать лекарства в нос. Необходимо, чтобы в глотке и в носовой полости накопилась мокрота с возбудителем заболевания.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) — исследование бактериальной ДНК. Метод ПЦР позволяет диагностировать коклюш на молекулярно-генетическом уровне. Биологический материал получают при заборе мокроты больного коклюшем. Метод полимеразной цепной реакции часто используют при отрицательных результатах бактериологического исследования.

Лабораторный иммуноферментный анализ подходит для периода заболевания, когда в организме уже вырабатываются антитела. Методика ИФА основывается на качественном определении антигенов и специфических антител в кровяной плазме. Наличие иммуноглобулинов М характерно для самого заболевания, а иммуноглобулины G циркулируют в крови уже после перенесенной инфекции.

Если антител к антигенам возбудителя в анализе крови на коклюш не обнаружат, то ребенок не болен и не перенес инфекцию ранее.

Серологический тест может назначаться для ретроспективной диагностики коклюша, выявления очага инфекции и предупреждения ее распространения. Расшифровка результата покажет в крови больных и переболевших детей повышение уровней специфических иммуноглобулинов М и G к токсинам бактерий Bordetella.

Общий анализ крови при коклюше указывает на наличие либо отсутствие воспалительного процесса в организме ребенка. Заболевание коклюшем можно заподозрить при повышенном количестве лимфоцитов и лейкоцитов, при этом показатели СОЭ будут в норме. Врачи рекомендуют сдавать кровь на анализ в утренние часы, перед завтраком.

Лечение коклюша в РФ включено в программу ОМС, в государственных медучреждениях проводят все необходимые мероприятия. Альтернативная возможность обследования — обращение в диагностические центры «Инвитро». Врач-консультант лаборатории объяснит назначение каждого анализа, даст его подробную расшифровку.

Как проводится лабораторная диагностика (анализы) коклюша и паракоклюша? обновлено: Май 17, 2016 автором: admin

Коклюш является бактериальной инфекцией с воздушно-капельным механизмом передачи.

В общем анализе крови у детей больных коклюшем выявляют пониженное количество лейкоцитов (2-7*10 9 /л), в преобладают лимфоциты. Нужно учитывать что степень повышения уровня зависит от степени тяжести заболевания, а у привитых, ослабленных, детей со стертыми формами коклюша изменения в анализе отсутствуют. в пределах нормы или снижена. Сдвиги в картине крови находят только в катаральной стадии коклюша.

Общий анализ мочи и биохимический анализ крови проводят с целью выявления возможных осложнений. При благоприятном течении коклюша они не изменены.

Общий анализ мокроты дает возможность отличить коклюш от бронхиальной астмы, туберкулеза, . Мокрота при коклюше слизистая, в случае присоединения пневмонии становится слизисто-гнойной или гнойной.

Читайте также:  Что показывает анализ крови тройка

Значительную помощь врачу в постановке диагноза, особенно в ранней стадии, оказывает бактериологический метод исследования — посев на питательные среды. Длительное время для выявления бактерии коклюша использовали метод «кашлевых пластинок», предложенный Мауритценом. Во время приступа кашля на расстоянии 5-8 см от ребенка размещают открытую чашку Петри с питательной средой. Микроскопические капли слизи, содержащие бактерию коклюша, вылетают изо рта и оседают на питательной среде. Через 2-4 дня по полученной культуре микробов можно поставить диагноз. Данный метод имеет недостаток — он малоэффективен у маленьких деток, которые «плохо» кашляют и детей у которых кашля нет.

Более современный метод определения возбудителя коклюша — бактериологический посев материала из носоглотки и из-под язычка. Бактериологический метод диагностики коклюша — самый эффективный, но после 4-5 недели от начала заболевания проводить его не целесообразно, возбудитель не выделяется. Ранее начало приема антибиотиков также снижает вероятность определения бордетеллы коклюша.

Ранее использовались РСК и РПГА. Повышения титра антител к коклюшу в четыре раза подтверждает диагноз.

Иммунологические методы анализа крови и выделений из носа при коклюше выявляют наличие антител — (Ig M) (в крови) и (IgA) (слизь из носа) начиная с 3 недели заболевания. Сохраняются они в повышенных концентрациях на протяжении 3-4 месяцев. к коклюшу начинают образовываться через 4 недели от начала болезни и сохраняются в крови несколько лет. Но их анализ имеет ретроспективное значение, позволяя судить о том, переболел ли ребенок коклюшем.

Анализы при коклюше was last modified: Август 10th, 2017 by Мария Бодян

Коклюш – острая инфекция верхних дыхательных путей, которая передается воздушно-капельным путем и характеризуется мучительным спастическим кашлем. Заболеванию в основном подвержены дети дошкольного возраста, а в редких случаях может произойти заражение взрослых людей, переболевших коклюшем в детском возрасте. Виновником является аэробная грамотрицательная коккобацилла Bordettella pertussis. Анализ на коклюш – поможет своевременно выявить патологию и определить верную тактику лечения.

Коклюш относится к очаговым инфекциям, вспышки которых отмечаются каждые 4-5 лет. Перенесенное в детстве заболевание не гарантирует стойкого иммунитета, поэтому иногда случается рецидив болезни. Многих волнует вопрос: «Сколько проходит времени после прививки, чтобы организм человека стал уязвимым по отношению к инфекции?» Через 12-15 лет после введения вакцины, иммунитет ослабевает и у вновь заболевших инфекция протекает со смазанной симптоматикой – без характерных приступов кашля, как обычная ОРВИ. Опасность заключается в том, что люди, не подозревающие о заболевании, могут, стать источником заражения для новорожденных не прошедших вакцинацию.

Болезнь представляет особую опасность для людей с ослабленным иммунитетом, бронхиальной астмой и может вызвать типичные осложнения:

  • поражения бронхов, легких и сердечно-сосудистой системы;
  • пневмококлюш;
  • конъюнктивальные кровоизлияния;
  • энцефалопатию;
  • пневмонию и бронхит;
  • асфиксию.

Входными воротами для инфекции является поверхность верхних дыхательных путей. Возбудитель заселяет слизистую эпителия гортани, трахеи и бронхов. Экзотоксины, выделяемые колонизатором в кровь, вызывают чувствительность к гистамину, раздражают дыхательный центр и вызывают приступы кашля.

Инкубационный период длится от 5 до 14 дней и характеризуется катаральными явлениями: легким кашлем, насморком, слегка повышенной температурой тела.

По окончании инкубационного периода возбудитель инфекции начинает выделять токсины. В это время проявляются основные симптомы: упорный спазматический кашель с серией кашлевых толчков и свистом на вдохе, так называемой репризой. По окончании выделяется вязкая мокрота, иногда приступ может закончиться рвотой, а в тяжелых случаях асфиксией и судорогами. В этот период в крови значительно повышен уровень специфических иммуноглобулинов. Обострение может продолжаться около месяца, после чего приступы становятся реже и заканчиваются обычным кашлем, который полностью проходит через несколько недель.

Заболевание диагностируется с учетом данных анамнеза и результатов лабораторных исследований.

В соответствии с лечебным протоколом для диагностики применяют несколько видов лабораторных исследований. Выбор метода зависит от предполагаемого срока инфицирования:

  • бактериологический посев на коклюш – делается в периоде 2-3 недель от начала заболевания;
  • ПЦР — молекулярно – генетический – метод позволяет определить ДНК бактерии, и информативен в первые несколько недель от начала инфекции;
  • серологические методы (РНГА, РА, РПГА) – используются для диагностики на поздних сроках;
  • общий анализ крови;
  • к инструментальным методам исследования можно отнести флюорографию, которая выполняется для исключения пневмонии, плеврита или острого бронхита.

Целью исследований является лабораторное подтверждение диагноза, определение степени тяжести и своевременное выявление осложнений, какие очень часто могут вызывать хронические патологии. В настоящее время внедряются экспресс-методы диагностики, которые позволяют уже через несколько часов расшифровать диагноз или выявить другие заболевания со схожими симптомами. У детей, не прошедших вакцинацию, для определения возбудителя применяют такой метод, как ПЦР. Для ранее вакцинированных наиболее эффективны серологические исследования.

Бактериологический метод считается золотым стандартом для обнаружения инфекции на начальной стадии заболевания. Посев на коклюш или бак-исследование проводиться в катаральном периоде и заключается в заборе материала с задней стенки глотки (мазок). Бактерии высевают на питательную смесь и проращивают в стерильных условиях с последующим их тщательным изучением. Рост микробов происходит в течение нескольких дней, что дает возможность диагностировать или исключить коклюш. Своевременное выявление коккобациллы, достоверная и быстрая расшифровка исследования позволяет начать лечение на ранних стадиях и предупредить возможные осложнения.

Необходимо отметить, что бактериологическое исследование наиболее эффективно в катаральной стадии заболевания. Анализ не определяет возбудителя коклюша в позднем периоде или на фоне приема антибиотиков.

Забор образца не сопровождается неприятными явлениями или дискомфортом, хотя маленькие дети активно сопротивляются попыткам взять мазок. В таких случаях пробу могут взять тампоном из носа. Сдавать анализ рекомендуется утром, когда в дыхательных путях, носовых проходах и гортани скопилось значительное количество слизи и мокроты. Как оптимальный вариант можно рассматривать забор материала перед чисткой зубов и утренним приемом пищи.

Серологическая диагностика не подходит для раннего выявления возбудителя, так как антитела в крови вырабатываются только после третьей недели болезни. В основном исследования проводят для ретроспективного определения коклюша, позволяя ставить верный диагноз после того, как человек выздоровел. Методика эффективна при обследовании очагов инфекции для предотвращения эпидемии.

  • РПГА – иммунологический метод реакции непрямой гемагглютинации клеток. Максимально точно определяет титр антител в крови к возбудителю, и позволяет узнать, какие виды микроорганизмов присутствуют на момент изучения исследуемого материала. Помимо этого, анализ определяет чувствительность к антибиотикам, что позволяет подобрать наиболее эффективные препараты для терапии. Сдавать кровь из вены рекомендуется натощак.
  • ИФА – иммуноферментное экспресс-исследование крови, позволяющее выявить наличие иммуноглобулинов М, что является доказательством заболевания; обнаружение иммуноглобулинов G в сыворотке крови свидетельствует о перенесенной инфекции, а отсутствие антител как таковых, позволяет убедиться в том, что человек не болен коклюшем на данный период времени и никогда не был инфицирован раньше.
  • ПЦР – полимерная цепная реакция. На сегодняшний день самый достоверный метод обнаружения инфекций. Для исследования чаще всего собирают мокроту. Методика эффективна в отношении изменчивых возбудителей и может использоваться не только для исследования материала, полученного от больного, но и для обследования объектов внешней среды, таких как вода и верхний слой почвы. ПЦР-анализ сдают больные в тех случаях, когда невозможно обнаружить возбудителя инфекции бактериологическим и иммунологическими методами. Для получения результатов не требуется выращивание колоний возбудителя, а полная автоматизация процесса и высокое качество реактивов не позволяют сколько-нибудь усомниться в достоверности результата.

Общий анализ крови традиционно используется для выявления воспалительных реакций в организме. Для большей точности кровь сдают натощак в утреннее время. На наличие заболевания может указать характерное сочетание следующих показателей:

  • СОЭ – норма;
  • лимфоциты и лейкоциты – повышены.

Ухудшение экологии и интенсивность городской жизни обуславливает возникновение заболеваний, требующих быстрой, точной диагностики и расшифровки анализов для проведения адекватного лечения. В настоящее время обследование на наличие коккобациллы Bordettella pertussis не представляет сложности. Благодаря высокому уровню развития медицинских технологий многие заболевания, в том числе и коклюш, удается выявить на ранних стадиях и предотвратить осложнения, какие обычно наступают после несвоевременного выявления причин. В России, лечение коклюша входит в программу ОМС, и государство гарантирует необходимые обследования и терапевтические мероприятия.

Альтернативой ОМС может стать обращение в одну сетевых лабораторий, например, ИНВИТРО. Компания использует передовые методы исследований и на сегодняшний день является самой технологичной. Медицинские офисы, работающие под брендом ИНВИТРО, располагают лучшими специалистами, которые без проблем проведут забор материала, в том числе и у малышей. На вопрос: «Сколько стоит обследование?» – можно с уверенность ответить, что это не нанесет значимый урон семейному бюджету. Исследования проводятся в максимально сжатые сроки, а врач-консультант лаборатории ИНВИТРО досконально разъяснит целесообразность тех или иных анализов, ответит на все интересующие пациента вопросы и проведет расшифровку результатов. Также специалист ИНВИТРО обозначит стратегию лечения и подскажет, в каких клиниках могут предложить эффективное лечение.

Коклюш относится к детским острым инфекционным заболеваниям, так как им болеют в основном дети. Для данного заболевания характерны приступы спазматического судорожного кашля на фоне общего недомогания ребенка. Симптомы коклюша во многом схожи с признаками других болезней. Поэтому для того, чтобы дифференцировать это заболевание, необходимо сдать анализ на коклюш.

Источником заражения коклюшем бывает больной человек либо здоровый носитель бактерий возбудителей болезни. Особенно заразными являются больные в катаральном периоде (начальной стадии) заболевания. Инфекция передается воздушно-капельным путем. Восприимчивость к данному заболеванию достаточно высока – до 90%. В группе риска заражения коклюшем находятся дети дошкольного возраста.

Противококлюшные прививки, как и перенесенный ранее коклюш, не обеспечивают пожизненного иммунитета. Повторное заражение инфекцией вполне возможно. На взрослых людей приходится около 5% заражений коклюшем.

Инкубационный период данного заболевания обычно составляет 5–7 суток, хотя иногда может быть и 2–14 суток. К начальным симптомам коклюша относятся общее недомогание, насморк, небольшой кашель, незначительное повышение температуры тела. Затем кашель усиливается, ребенок становится раздражительным, капризным. Через 10–14 суток с момента начала заболевания наступает период спазматического кашля.

Особенностью кашля при коклюше являются судорожные серии кашлевых толчков, которые после глубокого свистящего вдоха переходят в короткие судорожные толчки. Количество таких циклов во время приступа может колебаться от 2 до 15. В конце приступа выделяется стекловидная вязкая мокрота, иногда возможна рвота. Во время приступа кашля лицо ребенка краснеет, шейные вены расширяются, изо рта высовывается язык, что часто приводит к травмированию уздечки языка. В некоторых случаях у малыша наступает остановка дыхания.

Продолжительность периода судорожного кашля составляет три–четыре недели. После этого количество приступов уменьшается, постепенно прекращаясь полностью. Но еще на протяжении двух–трех недель у больного наблюдается незначительный кашель.

У взрослых больных коклюшем отсутствуют приступы судорожного кашля, присутствует упорный кашель значительно меньшей интенсивности. При этом общее самочувствие взрослых остается нормальным, температура тела не повышается.

Паракоклюш – инфекционное острое заболевание, которое имеет сходные симптомы с коклюшем, но протекает более легко. В отличие от коклюша, при паракоклюше редко бывают осложнения.

Как видно, коклюш – достаточно тяжелое заболевание. Поэтому так важно провести его своевременную диагностику. Для этого врач обычно назначает анализ на коклюш и паракоклюш.

Где сдать анализ на коклюш? Данные исследования проводят лаборатории при диагностических центрах, клиниках. По направлению врача такие анализы проводят в лабораториях поликлиник по месту жительства или при инфекционных отделениях.

Существуют анализы крови на коклюш и бактериологические методы посева.

На ранней стадии заболевания достаточно информативным является такой бактериологический метод исследования, как посев на питательные среды. Долгое время для определения бактерии коклюша врачи применяли метод «кашлевых пластинок», который был предложен специалистом Мауритценом. Когда у ребенка начинается приступ кашля, на расстоянии 5–10 см от него размещают чашку Петри, содержащую питательную среду. Капельки слизи, которые содержат возбудителя коклюша, вылетают изо рта ребенка и оседают в чашке Петри. Через 2–4 суток ставят диагноз по выросшей культуре микроорганизмов. Данный анализ на коклюш и паракоклюш нельзя применить у маленьких деток и у тех малышей, у которых нет кашля.

Более современным является метод бактериологического посева материала из-под язычка и из носоглотки. Хотя такое исследование очень эффективно, его можно применять только в первые три–четыре недели после начала болезни. В более поздний период возбудитель коклюша не определяется.

К наиболее информативным анализам крови на коклюш относятся иммуноферментный анализ (ИФА) и серологический метод.

Иммуноферментный метод исследования крови заключается в определении антител специфического белка иммуноглобулина IgG и IgM к возбудителю коклюша. Для проведения данного анализа у пациента производят забор крови из вены. Иммуноферментный анализ можно проводить не ранее трех недель с начала болезни. Поэтому он обычно используется для подтверждения заболевания после бактериологического исследования.

Серологический метод анализа крови на коклюш состоит в исследовании крови пациента на титр (концентрацию) антител к палочке коклюша. Обычно определяют нарастание концентрации (титра) специфических антител при регулярных исследованиях.

Высокоинформативным анализом на коклюш является метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данный метод молекулярной диагностики дает возможность выявить в биологическом материале (мазок из зева, носоглотки) фрагменты ДНК коклюшной палочки, и благодаря этому быстро и точно диагностировать коклюш. Специфичность данного метода исследования достигает 100%.

Какое именно исследование провести, где сдать анализ на коклюш, определяет врач. Вид необходимого обследования зависит от симптоматики и течения болезни, возраста больного.

источник

Определение в крови суммарных антител к возбудителям коклюша и паракоклюша.

Коклюш — острое инфекционное заболевание с воздушно-капельным механизмом передачи возбудителя, характеризуется длительным спазматическим кашлем с поражением дыхательной, сердечно-сосудистой и нервной систем. Чаще болеют дети до 5 лет. Возбудитель коклюша — Bordetella pertussis — грамотрицательная коккобацилла. Инкубационный период продолжается от 2 до 14 дней (чаще 5-7 дней). Катаральный период характеризуется общим недомоганием, небольшим кашлем, насморком, субфебрильной температурой. Постепенно кашель усиливается, дети становятся раздражительными, капризными. В конце 2-й недели болезни начинается период спазматического кашля. Приступы судорожного кашля начинаются внезапно, проявляются серией кашлевых толчков, затем следует глубокий свистящий вдох, за которым снова следует ряд коротких судорожных толчков. Число таких циклов во время приступа колеблется от 2 до 15. Приступ заканчивается выделением вязкой стекловидной мокроты, иногда в конце приступа отмечается рвота.

Паракоклюш – заболевание, подобное коклюшу, но с более легким течением. Возбудитель паракоклюша — Bordetella parapertussis, в отличие от коклюшного микроба, имеет большие размеры. Средняя длительность инкубационного периода при паракоклюше составляет 10-15 дней. Общее самочувствие больных мало нарушается. Лишь у небольшого числа больных в первые дни болезни повышается температура. Нерезко выраженные катаральные явления — ринит и гиперемия зева — наблюдаются в начале заболевания и держатся 3-5 дней. Основным симптомом болезни является кашель. По характеру кашля выделяют две формы паракоклюша: типичная форма (с коклюшеподобным кашлем) и атипичная (с трахеобронхиальным кашлем). С коклюшеподобным кашлем протекает от 11 до 20% случаев паракоклюша. Кашель длится 2-3 недели, редко больше.

Большую опасность для детских организованных коллективов представляют дети и взрослые, переносящие заболевание в стертой форме.

В клинической лабораторной диагностике коклюша и паракоклюша применяют несколько методов: бактериологический метод, предназначенный для выявления роста колоний возбудителя, метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), направленный для выявления генетического материала возбудителей, серологический метод,основанный на обнаружении в сыворотке крови специфических антител. Диагноз ставится при подтверждении клинического диагноза хотя бы одним из указанных методов.

Антитела к возбудителям коклюша и паракоклюша могут быть обнаружены через 1-2 недели после возникновения первых симптомов заболевания (эти сроки могут быть увеличены у новорожденных детей). Основными антигенами, взаимодействующими с anti-Bordetella pertussis и anti-Bordetella parapertussis, являются филаментозный гемагглютинин, коклюшный токсин, белок пертактин, липоолигосахарид и фимбриальные антигены. В ответ на инфекцию вырабатываются все классы иммуноглобулинов. Реакция пассивной гемагглютинации (РПГА)– непрямой метод диагностики, результаты которого зависят от особенностей иммунной системы пациента. Данная реакция используется для диагностики коклюша и паракоклюша, а также для оценки эффективности вакцинации АКДС (адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная прививка). Следует учитывать, что у детей в возрасте до 3 месяцев собственные антитела не вырабатываются, но могут присутствовать материнские антитела, которые, как правило, определяются в низких титрах.

В течение 1 года после вакцинации против коклюша не рекомендуется проводить серологическое исследование в диагностических целях, так как данная реакция не позволяет различить иммунологический ответ, вызванный текущей инфекцией и вакцинацией: результат РПГА будет положительным даже при отсутствии текущей инфекции. Титр защитных антител постепенно снижается в течение первых 1-3 лет после заболевания или вакцинации.С особой осторожностью следует трактовать результаты РПГА у пожилых пациентов, а также у пациентов с иммуносупрессией (ВИЧ-инфекция, прием глюкокортикостероидов).

Кровь рекомендуется сдавать не ранее чем через 4 часа после последнего приема пищи (воду пить можно).

Материал для исследования: сыворотка крови

    Дополнительное лабораторное тестирование в комплексе клинических и микробиологических исследований при диагностике коклюша и паракоклюша. Длительный кашель при отсутствии бактериологического подтверждения диагноза. Обследование лиц, находившихся в тесном контакте с больными коклюшем или паракоклюшем. Оценка наличия иммунитета и эффективности вакцинации. Эпидемиологические исследования. Ретроспективная диагностика.

Интерпретация результатов содержит аналитическую информацию для лечащего врача. Лабораторные данные входят в комплекс всестороннего обследования пациента, проводимого врачом и не могут быть использованы для самодиагностики и самолечения.

Исследование позволяет полуколичественно определить суммарные антитела к возбудителю коклюша и паракоклюша, уровень антител выдается в титре. Уровень антител в титре менее 1:20 расценивается как отрицательный. Полученные результаты необходимо сопоставлять с эпидемиологическими, клиническими и другими лабораторными данными.

При использовании реакции для оценки противококлюшного иммунитета следует считать титр 1:160 – условно-защитным титром, титр 1:320 – защитным титром. Диагностическим титром реакции агглютинации у непривитых и неболевших детей считается титр 1:80.

У иммунизироанных детей и взрослых положительные реакции учитывают при исследовании парных сывороток крови, взятых с интервалом 1-2 недели при нарастании титра не менее чем в 4 раза.

§ отсутствие коклюша или параклюша;

§ ранние сроки инфицирования и отсутствие синтеза специфических антител.

§ неэффективная вакцинация АКДС;

§ угасание иммунологического ответа после вакцинации АКДС.

§ текущая или имевшая место в прошлом инфекция;

§ иммунный ответ после вакцинации АКДС.

Комплексное исследование, направленное на диагностику коклюша и паракоклюша, а также на оценку эффективности вакцинации против коклюша.

Возбудители коклюша, паракоклюша; комплексное обследование.

Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis; comprehensive examination.

Реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), полимеразная цепная реакция в режиме реального времени.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Венозную кровь, мазок из носоглотки, мазок из зева (ротоглотки).

Как правильно подготовиться к исследованию?

    Не курить в течение 30 минут до исследования.

Общая информация об исследовании

Коклюш представляет собой острую антропонозную бактериальную инфекцию. Возбудитель – Bordetella pertussis (палочка Борде-Жонгу), мелкая неподвижная грамотрицательная коккобацилла, строгий аэроб. Инфекция передается воздушно-капельным путём. Источником инфекции является больной человек с любой формой инфекционного процесса.

В течении заболевания выделяют следующие периоды: инкубационный период (длительностью от нескольких дней до двух недель), катаральный (от 5-8 до 11-14 дней), пароксизмальный или спазматический (2-8 недель), разрешения (2-4 недели) и реконвалесценции (2-6 месяцев). Наиболее характерными для коклюша являются проявления, характеризующие пароксизмальный период заболевания. К ним относятся сухой спастический кашель, цианоз носогубного треугольника, акроцианоз, возможна рвота, лихорадка, слабость, в гемограмме – лейкоцитоз, лимфоцитоз. Следует отметить, что наиболее тяжело заболевание протекает у детей раннего возраста, возможно развитие осложнений со стороны бронхолегочной и нервной систем. У взрослых и лиц после вакцинации коклюш чаще протекает в легкой, атипичной форме, как правило, без осложнений.

Читайте также:  Кровь на анализы при профосмотре

Паракоклюш – это острая бактериальная инфекция респираторного тракта, поражающая детей и взрослых. Возбудителем инфекции является аэробная палочка Bordetella parapertussis. Клинические проявления данного заболевания схожи с картиной коклюша, характерна более стертая смена периодов, легкое течение, редкое развитие осложнений, преимущественно у детей.

Диагностика коклюша и паракоклюша основана на клинико-эпидемиологических данных, результатах изменений в клиническом анализе крови и подтверждается лабораторными методами. В клинической лабораторной диагностике данных заболеваний применяют несколько методов: бактериологический метод для выявления роста колоний возбудителей коклюша/паракоклюша; серологический метод, направленный на определение суммарных антител к данным возбудителям; метод полимеразной цепной реакции (ПЦР) – для выявления генетического материала возбудителя коклюша.

Бактериологическое обследование является первым этапом диагностики, но позволяет выявлять возбудителей только на ранних сроках заболевания, в первые 2-3 недели.

Метод ПЦР является высокоэффективным в диагностике коклюша, позволяет выявлять фрагменты ДНК возбудителя B. pertussis в исследуемом биоматериале, обладает высокой диагностической специфичностью, достигающей 100 %. Использование данного метода рекомендовано в первые три недели от начала клинических проявлений заболевания, то есть в катаральный и ранний пароксизмальный период. В более поздние сроки заболевания диагностическая чувствительность метода падает. Следует отметить, что в отличие от других лабораторных методов, ПЦР является эффективным на фоне лечения антибактериальными препаратами. Также он используется при обследовании детей раннего возраста, в отличие от более старших детей и взрослых, когда возможно возрастание числа ложноположительных результатов. У лиц, вакцинированных против коклюша, положительный результат данного метода может свидетельствовать о транзиторном носительстве патогена, а не об активной форме заболевания.

Серологическое обследование позволяет выявлять в сыворотке крови специфические антитела, направленные к антигенам возбудителей B. pertussis и B. parapertussis. Они могут быть обнаружены с помощью реакции непрямой гемагглютинации (РНГА).

При выборе РНГА в качестве диагностического теста при подозрении на коклюш и паракоклюш следует учитывать клинический период заболевания, возраст пациента и наличие предшествующей вакцинации. Для подтверждения диагноза необходимо определение нарастания титра антител в четыре и более раза в парных сыворотках, взятых с интервалом 10-14 дней. Реакцию ставят параллельно с коклюшным и паракоклюшным антигеном. Серологическое обследование рекомендовано применять в период 3-6 недель от начала первых клинических симптомов заболевания, характеризующий пароксизмальный период коклюша. Данный метод не рекомендуется применять детям до 3 месяцев, так как иммунная система новорожденных в данный период ещё не зрелая и могут быть обнаружены материнские антитела в низких титрах. Также не рекомендуется проводить серологическое исследование лицам в течение 1 года после вакцинации против коклюша вследствие невозможности различить иммунный ответ на вакцинацию или на первичную инфекцию. Титр антител к B. pertussis может быть определtн для оценки эффективности прививки против коклюша у детей.

Рекомендуемая схема клинической лабораторной диагностики коклюша/паракоклюша

ПО БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОМУ И СЕРОЛОГИЧЕСКОМУ

ИССЛЕДОВАНИЯМ ПРИ КОКЛЮШЕ И ПАРАКОКЛЮШЕ

(для бактериологических лабораторий

санитарно-эпидемиологических станций и больниц)

Инструкция по бактериологическому и серологическому исследованиям при коклюше и паракоклюше составлена научными сотрудниками Московского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Г.Н. Габричевского.

Массовые прививки против коклюша значительно изменили клиническое течение заболевания, что затруднило своевременную постановку диагноза. С помощью лабораторных исследований возможно подтверждение клинического диагноза, выявление атипичных форм заболевания, обнаружение бактерионосителей в окружении больного, а также установление ретроспективного диагноза.

В настоящей Инструкции нашли отражение результаты научных исследований последних лет в области изучения биологических свойств бактерий рода Bordetella, разработки питательных сред и др. Инструкция предусматривает дифференциальную диагностику всех представителей рода бордетелла: B. pertussis, B. parapertussis и B. bronchiseptica на основе выделения чистой культуры и изучения всего комплекса биологических признаков.

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБОВ РОДА БОРДЕТЕЛЛА

Клинический синдром коклюша может быть вызван тремя возбудителями: B. pertussis, B. parapertussis и в единичных случаях B. bronchiseptica . Бактериологическое исследование является единственным методом дифференциальной диагностики этих заболеваний, а также случаев смешанной инфекции.

Бронхисептические микробы являются частыми обитателями дыхательных путей животных (кролики, морские свинки, кошки, собаки и др.).

Возбудители клинического синдрома коклюша относятся к микробам рода Bordetella семейства Halobacterium. Все они грамотрицательные мелкие палочки (коккобактерии), располагаются по одиночке или группами, имеют нежную капсулу, неподвижные (B. pertussis и B. parapertussis) или подвижные (B. bronchiseptica), строгие аэробы. Для роста бордетелл необходимо присутствие различных аминокислот (цистин, пролин, метионин, серин, глютамин и др.), а также никотиновой кислоты, различных солей и др. Оптимальная температура для их роста 35 — 37 °C. Бордетеллы обладают низкой ферментативной активностью: не образуют индола, не разжижают желатин, не ферментируют сахаров. Особенно биохимически мало активна палочка коклюша.

Микробы рода бордетелла имеют общие для всего рода антигены (родовые) и специфические, характерные для каждого вида возбудителя (видовые). Наличие общих родовых антигенов обуславливает положительную реакцию агглютинации с гомологичными и гетерологичными неадсорбированными сыворотками (коклюшные и паракоклюшные) и свидетельствует о наличии у больного микробов рода бордетелла. Видовые антигены (агглютиногены) бордетелл являются специфическим антигенным комплексом (фактором) и условно обозначены для коклюшного микроба цифрой 1, паракоклюшного микроба — 14 и бронхисептического — 12. Адсорбированные монорецепторные сыворотки к видовым антигенам (факторам), 1, 14 и 12 используют для дифференциации вида у представителей рода бордетелла.

Различают 4 сероварианта (серовара) коклюшного микроба, которые определяют с помощью реакции агглютинации на стекле со специфическими монорецепторными сыворотками к антигенам (факторам), обозначенным цифрами 1, 2, 3. Методика постановки реакции показана в приложении к сывороткам. По сочетанию факторных антигенов различают сероварианты коклюшного микроба, обозначенные как 1, 2 — 1, 2, 0 — 1, 0, 3 — 1, 0, 0.

0 — отсутствие факторных антигенов.

Характеристика различных свойств микробов рода бордетелла представлена в таблице 1.

ХАРАКТЕРИСТИКА МИКРОБОВ РОДА БОРДЕТЕЛЛА

ПОКАЗАНИЯ К ЛАБОРАТОРНОМУ ИССЛЕДОВАНИЮ

Лабораторная диагностика заболеваний коклюшем и паракоклюшем осуществляется двумя методами: бактериологическим, при котором выделяют возбудителя из слизи с задней стенки глотки, и серологическим, при котором определяют специфические антитела в сыворотке больного или переболевшего. Бактериологический метод обследования является методом ранней диагностики заболеваний, серологический — используют для ретроспективного установления диагноза.

Бактериологическое исследование проводят с диагностической целью и по эпидемическим показаниям.

С диагностической целью обследуются:

1. Дети с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания по клиническим показаниям.

2. Дети, которые кашляют в течение 5 — 7 и более дней, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем или паракоклюшем.

3. Взрослые с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которые работают в родильных домах, детских больницах, санаториях, яслях, детских садах, школах, а также в закрытых детских коллективах для детей дошкольного и школьного возраста.

4. Взрослые, работающие с детьми в указанных выше учреждениях, которые кашляют в течение 5 — 7 и более дней, независимо от указаний на контакт с больным коклюшем или паракоклюшем.

По эпидемическим показаниям обследуются лица, общавшиеся с больными коклюшем или паракоклюшем:

1. Дети, посещающие ясли, детские сады, закрытые детские коллективы для детей ясельного и дошкольного возраста или находящиеся в детских больницах, санаториях, а также дети до 7 лет, общавшиеся с больным коклюшем или паракоклюшем в домашних условиях.

2. Взрослые, работающие в указанных выше учреждениях и общавшиеся с больными коклюшем или паракоклюшем в домашних условиях.

Основным методом лабораторной диагностики является бактериологический, при котором производится посев исследуемого материала на оптимальные питательные среды и выделение чистой культуры с последующей идентификацией возбудителя. Бактериологическое исследование с диагностической целью следует проводить в ранние сроки заболевания (но не позднее 3-й недели) двукратно ежедневно или через день, так как в более поздние сроки высеваемость возбудителя резко снижается. Необходимость обследования в детских учреждениях и его сроки устанавливает эпидемиолог.

Исследуемым материалом является слизь из верхних дыхательных путей, осаждающаяся при кашле на задней стенке глотки. Взятие материала может проводиться двумя способами: а) заднеглоточным тампоном и б) «кашлевыми пластинками».

Заднеглоточным тампоном материал забирают как с диагностической целью, так и по эпидемическим показаниям. Метод «кашлевых пластинок» используют только с диагностической целью при наличии кашля. У детей грудного возраста рекомендуется брать материал заднеглоточным тампоном.

Взятие материала заднеглоточным тампоном должно проводиться специально выделенным инструктированным персоналом: медицинскими сестрами детских поликлиник и детских учреждений, помощниками эпидемиологов, лаборантами. Материал берут в детских поликлиниках в специально выделенном помещении, исключающем конта кт с др угими детьми, а также в детских учреждениях и на дому. При заборе материала должна быть полностью исключена возможность взаимного заражения обследуемых . Материал забирают натощак или через 2 — 3 часа после еды.

Взятие материала у взрослых производят в бактериологических лабораториях санэпидстанций и в детских учреждениях при обследовании на коклюш и паракоклюш.

Для взятия материала используют два вида тампонов, предварительно изогнутых под тупым углом (до его стерилизации): а) сухой и б) увлажненный . Материал, взятый сухим тампоном, засевают немедленно на одну из рекомендуемых питательных сред, а при взятии материала увлажненным тампоном его доставляют для посева в лабораторию, но не позднее 2 — 4 часов после взятия материала.

Методика взятия материала сухим и увлажненным тампонами одинакова и сводится к следующему. Медицинский работник левой рукой фиксирует с помощью шпателя корень языка, а правой вводит тампон в полость рта, продвигая его за корень языка. Тампон не должен касаться слизистой щек, языка и миндалин. Кончиком тампона и выпуклой его частью касаются задней стенки глотки, проводя по ней справа-налево 2 — 3 раза. Затем также осторожно над шпателем извлекают тампон из полости рта. В обоих случаях посев желательно производить на 2 чашки Петри. Если ребенок проявляет признаки беспокойства, то стоящий за его спиной помощник сзади фиксирует голову.

Взятие материала «кашлевыми пластинками», кроме медицинского персонала, можно поручить родителям, хорошо проинструктировав их. Сбор материала производят на 2 чашки с питательной средой. Во время приступа кашля левой рукой снимают крышку чашки, а правой подносят ее ко рту на расстоянии 10 — 12 см так, чтобы капельки слизи из дыхательных путей попали на поверхность среды. Чашку в таком положении держат некоторое время (в течение 6 — 8 кашлевых толчков). При непродолжительном покашливании можно эту чашку поднести повторно. На питательную среду не должны попадать слюна, рвотные массы, мокрота. Затем чашку с питательной средой закрывают крышкой и доставляют в лабораторию.

При посеве материала с диагностической целью рекомендуется использовать 2 чашки со средой КУА, а по эпидемическим показаниям — 1 чашку.

Для увеличения числа положительных находок коклюшного и паракоклюшного микробов сбор материала рекомендуется производить двумя тампонами: сухим и смоченным забуференным физиологическим раствором по прописи Е.А. Кузнецова . Взятие материала сухим тампоном стимулирует кашель и повышает возможность выделения возбудителя при взятии материала вторым влажным тампоном. Материал с сухого тампона засевают на чашку Петри обязательно на месте взятия его, а с влажного посев можно произвести после доставки тампона в лабораторию.

ДОСТАВКА МАТЕРИАЛА И ОФОРМЛЕНИЕ НАПРАВЛЕНИЯ

Материал на увлажненных тампонах и посевы материала, сделанные в учреждении, необходимо направлять в лабораторию. При транспортировке следует оберегать материал от прямых солнечных лучей, сохраняя его в температурных пределах от +4 до +37 °C. Для чего рекомендуется помещать весь материал в специальные ящики, биксы с защищающей прокладкой (марлевые ватники, грелки и др.). На доставляемый в лабораторию материал должно быть оформлено направление, где указывается:

а) Наименование учреждения, направившего материал на исследование.

б) Фамилия, имя, отчество, возраст и домашний адрес обследуемого .

д) Дата и время взятия материала.

ж) Наименование материала и метод взятия его.

з) Подпись лица, взявшего материал.

БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЙ МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактериологический метод исследования предусматривает выделение возбудителя заболевания путем посева на плотные питательные среды, выделение чистой культуры и идентификацию возбудителей рода бордетелла до вида. Исследование продолжается в течение 5 — 7 дней.

1. Посев материала, взятого тампоном, производят последовательно на 1 — 2 чашки с питательной средой, предварительно обработанной пенициллином или бициллином для подавления сопутствующей микрофлоры . Обработку антибиотиками можно проводить двумя способами: а) путем нанесения его на поверхность питательной среды; б) путем добавления в среду (см. Приложение). Для получения изолированных колоний посев материала производят путем тщательного втирания его тампоном вначале по периферии среды чашки Петри в виде 4 — 5 площадок, а затем Z-образным штрихом в центре чашки. Та же методика посева применяется на второй чашке. Стерильным шпателем растирают центральные части посева, не касаясь площадок.

При взятии материала «кашлевыми пластинками» среду антибиотиками не обрабатывают.

2. Засеянные чашки (тампоном или «кашлевыми пластинками») помещают в термостат при температуре 35 — 37 °C на 3 суток (72 часа). Для увлажнения воздуха в термостат ставят сосуд с водой.

3. В качестве питательной среды для посева исследуемого материала применяют среды, содержащие кровь: картофельно-глицериновый агар (среда Борде-Жангу) и молочно-кровяной агар или среды без крови; казеиново-угольный агар (КУА). Среды могут быть приготовлены в самих лабораториях (см. Приложение) или приобретены в Дагестанском НИИ питательных сред, который выпускает сухую питательную среду КУА.

Четвертый день исследования (3 сутки, 72 часа)

1. Просматривают посевы на чашках с питательной средой с целью отбора подозрительных колоний микробов рода бордетелла. Просмотр колоний производят при помощи бинокулярного стереоскопического микроскопа (МБС-1, МБС-2, МБС-3) или бинокулярной лупы с большим фокусным расстоянием (БМ-31-2).

2. Колонии микробов рода бордетелла при росте на плотных питательных средах выпуклые, влажные, гладкие, блестящие с ровными краями, серого цвета с голубоватым, жемчужным или металлическим, а иногда желтоватым или беловатым оттенком. Колонии всех трех видов бордетелла имеют мягкую (маслянистую) консистенцию и легко снимаются. При пересмотре колоний в стереоскопическом микроскопе можно наблюдать узкий луч света («хвостик»), отходящий от ее центра.

Колонии бронхисептического микроба в субкультуре могут быть двух видов: сходные с коклюшными и более плоские, с приподнятым центром.

Сроки появления колоний различны: колонии бронхисептического микроба появляются через 18 — 24 часа, паракоклюшного — через 24 — 48 часов и коклюшного — через 48 — 72 часа. Различная скорость роста отражается на величине колоний при просмотре их через 72 часа (см. таблицу). На средах с кровью вокруг колоний почти всегда образуется зона слабого гемолиза.

Рост коклюшного и бронхисептического микробов на питательной среде не сопровождается изменением ее цвета. Паракоклюшные микробы при обильном росте на среде КУА вызывают диффузное окрашивание среды в буровато-коричневый цвет, что выявляется при просмотре в проходящем свете, а также вызывают потемнение среды с кровью.

3. При наличии на среде выращивания подозрительных колоний производят выделение чистой культуры путем отсева их на скошенный КУА или в чашки Петри с одной из питательных сред. При этом поверхность среды делят на несколько секторов и отсевают каждую колонию на отдельный сектор, тщательно втирая ее в среду круговыми движениями.

4. При наличии значительного количества однотипных подозрительных колоний (см. § 2), помимо выделения чистой культуры, из оставшихся колоний делают мазки в физиологическом растворе, определяя морфологию культуры при окраске по Граму. Одновременно определяют также отсутствие спонтанной агглютинации. Микробы рода бордетелла имеют вид мономорфных мелких овоидных палочек (коккобактерий), равномерно располагаются в мазке, грамотрицательны. Иногда паракоклюшные микробы, особенно со среды Борде-Жангу, могут иметь вид удлиненных полиморфных палочек. Культуру из оставшихся колоний проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими видовыми неадсорбированными сыворотками , разведенными 1:10, и по возможности с адсорбированными монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1 и 14 . Если число подозрительных колоний значительно, то возможна постановка пробы Заксе для определения наличия фермента уреазы.

ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР выпускает коммерческие видовые специфические сыворотки «Коклюшная агглютинирующая сыворотка» и «Паракоклюшная агглютинирующая сыворотка».

«Сыворотки к агглютиногенам (факторам) 1, 2, 3 коклюшного микроба и 14 — паракоклюшного микроба» выпускаются ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи; сыворотка к агглютиногену 12 будет выпущена в ближайшее время.

5. На основании изучения характера колоний и морфологии клеток в мазках, окрашенных по Граму, положительной реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными и адсорбированными сыворотками к факторам 1 и 14 на третьи сутки можно выдать предварительный ответ.

6. При отсутствии роста подозрительных колоний на среде выращивания чашки Петри вновь помещают в термостат на 24 — 48 часов и просматривают повторно в соответствующие сроки.

Пятый-шестой день исследования (4 — 5 сутки, 96 — 120 час.)

1. Просматривают посевы, произведенные для выделения чистой культуры, и отмечают изменение цвета среды: паракоклюшные микробы диффузно окрашивают среду выращивания (КУА) в буровато-коричневый цвет.

2. На предметном стекле в капле физиологического раствора готовят мазки и окрашивают их по Граму, определяют морфологию выделенной культуры, ее чистоту, а также отсутствие спонтанной агглютинации.

3. Серологические свойства проверяют в реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками, разведенными 1:10, а также с адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14. Серовариант коклюшного микроба определяют агглютинацией с монорецепторными сыворотками к факторам 1, 2, 3.

4. Для проверки биохимических свой ств пр оизводят посевы чистой культуры на агаровую среду с тирозином (определение наличия тирозиназы), определяют наличие уреазы пробой Заксе (см. ниже) или посевом на бульон Хоттингера с мочевиной (см. Приложение). При подозрении на выделение чистой культуры бронхисептического микроба определяют утилизацию цитрата на среде Симмонса и подвижность путем посева на среду полужидкий агар (0,5% агар-агара).

B. pertussis биохимически инертна: не растет на мясопептонном агаре, не изменяет цвета агаровой среды с тирозином, не имеет фермента уреазы (проба Заксе отрицательная), не утилизирует цитраты.

B. parapertussis дает рост на простых питательных средах, изменяет среды с тирозином в коричневый цвет, обладает ферментом уреазой (проба Заксе положительная).

B. bronchiseptica отличается быстрым ростом на простых питательных средах, подвижностью, не изменяет цвета среды с тирозином, способна утилизировать цитраты на среде Симменса (см. табл. 1).

5. На основании изучения чистой культуры: морфологии колоний и клеток, реакции агглютинации с видовыми неадсорбированными сыворотками и адсорбированными монорецепторными сыворотками к факторам 1 и 14, результатов пробы на уреазу, изменения цвета среды с тирозином, утилизации цитратов может быть выдан окончательный положительный ответ.

6. Если в течение пяти суток (6 день исследования) на среде выращивания не обнаружены колонии, подозрительные для бактерий рода бордетелла, наблюдение прекращают и выдают окончательный отрицательный ответ.

МЕТОДИКА ИЗУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ И ЕЕ УЧЕТ

1. Для определения уреазной активности микробов смесь реактивов А (1 часть) и Б (19 частей) разливают по 0,1 — 0,2 мл в стерильные агглютинационные пробирки (с пробками) и вносят 1 — 2 петли испытуемой культуры. Пробирки помещают в термостат при 35 — 37° на 30 минут. Учет результатов производят после инкубирования, а при отсутствии изменения цвета смеси пробирки оставляют при комнатной температуре и результат учитывают на следующий день. Одновременно ставят контроль реактива без внесения культуры. При наличии у микробов фермента уреазы происходит расщепление мочевины до аммиака, что приводит к защелачиванию среды, изменяя ее цвет из желтого в малиновый.

Читайте также:  Общий анализ крови рязанский проспект

2. Для определения потребности в цитратах делают посев испытуемой культуры на скошенный агар среды Симмонса. Пробирки инкубируют при 37° одни сутки. Цитратассимилирующие бактерии хорошо растут, подщелачивают среду и вызывают окрашивание ее в синий цвет. Микробы, не ассимилирующие цитраты на этой среде, не растут и не меняют ее цвета.

3. Для определения пигментообразования производят посев выделенной культуры на простой питательный агар с 0,1% тирозина с инкубацией в течение суток при 37 °C. При расщеплении тирозина среда окрашивается в желто-коричневый цвет.

СХЕМА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

1-е сутки. 1. Посев исследуемого материала на среды выращивания и инкубирование в термостате при 35 — 37°.

1. Изучение характера колоний на средах выращивания с использованием стереоскопического микроскопа.

2. Отсев колоний для получения чистой культуры микроба.

3. При наличии большого числа колоний на среде выращивания:

а) приготовление мазков, окраска их по Граму, микроскопия;

б) постановка реакции агглютинации на стекле со специфическими неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками в разведении 1:10 и специфическими монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1 и 14;

в) постановка пробы на уреазу.

4. Выдача предварительного положительного результата проведенного исследования.

1. Изучение выделенной чистой культуры в случае наличия в исследуемом материале паракоклюшного или бронхисептического микробов: а) изучение характера роста чистой культуры и изменения цвета питательной среды, б) приготовление мазков и окраска их по Граму, микроскопия, в) постановка реакции агглютинации на стекле с видовыми неадсорбированными и монорецепторными сыворотками к агглютиногенам (факторам) 1, 14 и 12, г) постановка пробы на уреазу и учет результатов, д) посев на среду с МПА с тирозином, ж) при необходимости определение подвижности путем посева в столбик полужидкого агара и е) посев на среду Симмонса.

1. Изучение выделенной культуры коклюшного микроба или в случае позднего роста паракоклюшного по схеме 4-х суток исследования.

2. Учет результатов 4-х суток исследования.

3. Определение сероварианта коклюшного микроба.

4. Выдача окончательного ответа: положительного или отрицательного.

Примечание: При отсутствии роста подозрительных колоний на третьи сутки исследования чашки со средой выращивания просматривают на четвертые и пятые сутки. Дальнейший ход исследования продолжается по схеме.

АТИПИЧНЫЕ ШТАММЫ КОКЛЮШНОГО МИКРОБА

В очагах коклюшной инфекции могут быть обнаружены атипичные штаммы коклюшного микроба. Они отличаются от типичных культур морфологическими свойствами и характером колоний. В среде выращивания (КУА) такие штаммы образуют через 72 часа роста иногда более крупные колонии, с плоской поверхностью, западающим центром, имеют беловатый, бурый, желтоватый или слегка розоватый и зеленоватый цвет, маслянистую консистенцию. Морфология клеток в мазках из колоний может отличаться от типичной: встречаются более длинные палочки, раздутые овоидные палочки с ослизненным концом, формы в виде стрептобацилл. Чистая культура, выделенная из таких колоний, обладает типичными для коклюшного микроба свойствами. Биохимические и серологические свойства атипичных штаммов характерны для коклюшного микроба: они не разлагают мочевину и тирозин, агглютинируются на стекле специфическими видовыми неадсорбированными сыворотками, типируются моноспецифическими рецепторными сыворотками к факторам 1, 2, 3.

Примечание: В ряде случаев из зева детей и взрослых могут быть выделены грамотрицательные бактерии, сходные с коклюшным микробом по морфологии, виду колоний и серологическим свойствам. В чистой культуре они представляют собой грамотрицательные овоидные палочки, образуют сходные с типичными коклюшными микробами колонии, агглютинируются на стекле видовыми неадсорбированными коклюшными и паракоклюшными сыворотками, дают положительную реакцию агглютинации в пробирках в разведениях до 1:320 и не агглютинируются монорецепторными сыворотками. Специальные исследования в реакции иммуноэлектрофореза показали, что они не имеют антигенов, характерных для коклюшного и паракоклюшного микробов, и хорошо растут на простых питательных средах.

В случае обнаружения грамотрицательных бактерий, которые не могут быть идентифицированы как возбудители коклюша и паракоклюша, культуру можно пересылать в микробиологический отдел МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского .

125212, Москва, ул. Адмирала Макарова, 10.

Учитывая наличие атипичных штаммов коклюшного микроба, рекомендуется при выделении чистой культуры производить отсев с питательной среды максимального числа колоний всех видов, в среднем не менее пяти.

СРОКИ ВЫДАЧИ И ФОРМУЛИРОВКА ОТВЕТОВ

Ответ при исследовании на коклюш и паракоклюш выдается, как правило, на 3 — 5 сутки. Предварительный положительный ответ может быть выдан на третьи сутки с формулировкой: «Обнаружены микробы, подозрительные на бактерии рода бордетелла, исследование продолжается». Окончательный положительный ответ может быть выдан на 5 — 6 сутки и формулируется: «Обнаружены коклюшные (паракоклюшные, бронхисептические) микробы». Отрицательный ответ выдается на 5 сутки при отсутствии подозрительных колоний для бактерий рода бордетелла и формулируется: «Коклюшные (паракоклюшные, бронхисептические) микробы не обнаружены».

В случае замедленного роста микробов или выделения нетипичной культуры предварительный и окончательный ответы могут быть выданы позже (6 — 7 сутки).

Серологическая диагностика коклюша и паракоклюша заключается в обнаружении в исследуемой сыворотке специфических антител. Исследования производят на 2 — 3 неделе заболевания, когда в крови больных появляются специфические антитела. В связи с широкой иммунизацией против коклюша результаты серологических реакций могут иметь диагностическое значение только при изучении их в динамике, исследуя парные сыворотки больного не менее чем 2 — 3 раза с интервалом 1 — 2 недели. Серологические реакции следует ставить параллельно с коклюшным и паракоклюшным диагностикумами.

Кровь для исследования можно взять из пальца (0,8 — 1,0 мл) с соблюдением обычных правил асептики. Вытекающую кровь собирают, приложив к месту укола оттянутый (не слишком тонко) конец короткой пастеровской пипетки. Кровь из пипетки выдувают в центрифужную пробирку, которую затем помещают на 10 — 15 минут в термостат. Образовавшийся сгусток отделяют от стенки пробирки и помещают ее в холодильник до отделения сыворотки. Сыворотку отсасывают пастеровской пипеткой, разводят физиологическим раствором 1:5 или 1:10, плотно закрывают пробкой и хранят в холодильнике.

В случае когда удается взять кровь в лишь небольшом количестве, ее набирают в количестве 0,2 или 0,5 мл и вносят в пробирку, куда предварительно наливают 1,8 мл стерильного физиологического раствора. После центрифугирования смесь сыворотки с физиологическим раствором (разведение сыворотки соответственно 1:20 или 1:10) переносят в стерильную пробирку и из нее делают последующие 2-кратные разведения (1:20, 1:40 и т.д.).

Наиболее доступна в условиях практических лабораторий реакция агглютинации.

Для реакции агглютинации ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР выпускает коммерческие препараты: «Коклюшный диагностикум» и «Паракоклюшный диагностикум».

Из исследуемой сыворотки готовят 9 — 10 последующих разведений: 1:5, 1:10 и т.д. до 1:1280 или 1:2560. В 10-ю (или 11-ю) пробирку наливают вместо сыворотки 0,25 мл физиологического раствора (контроль). Реакцию агглютинации ставят в объеме 0,5 мл: к 0,25 мл соответствующего разведения сыворотки добавляют 0,5 мл диагностикума. Пробирки помещают в термостат при 37° на 2 часа и оставляют затем при комнатной температуре. Результаты учитывают на следующий день с помощью агглютиноскопа. Конечным титром считают разведение, при котором отмечается четкая агглютинация на два креста (++), однако реакция учитывается как положительная лишь при наличии в предыдущих пробирках четкой агглютинации на четыре или три креста (4+ или 3+).

Диагностическим титром реакции агглютинации у непривитых и неболевших детей считают разведение 1:80. У иммунизированных детей и взрослых положительные результаты реакции учитывают только при исследовании парных сывороток крови, взятых с интервалом в 1 — 2 недели при нарастании титра не менее чем в 4 раза.

Существуют и другие серологические реакции (РПГА, РСК и люминесцентно-серологический метод), не применяемые из-за отсутствия коммерческих препаратов.

МЕТОДЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД

(по методике ИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР в модификации

Московской городской санитарно-эпидемиологической станции)

Приготовление гидролизата казеина

Для приготовления казеинового гидролизата рекомендуется использовать казеин кислотный технический первого сорта, ГОСТ 1211-41, и пищевой кислотный, ТУ 153-54; активированный древесный уголь осветляющий марки А , ГОСТ 4453-48 (может быть использован активированный уголь и другой марки); соляную кислоту химически чистую с удельным весом 1,19.

Казеин отмывают 0,2-процентным раствором уксусной кислоты в течение 6 — 7 дней (25 мл 80-процентной уксусной кислоты на 10 л воды). В первый день раствор меняют три раза, а в последующие 5 — 6 дней по одному разу в день. Затем казеин промывают дистиллированной водой, хорошо отжимают и высушивают при температуре от 60 до 70° или при комнатной температуре.

Гидролизат казеина получают под давлением с помощью крепкой соляной кислоты. Для этого в стеклянной посуде (колба или бутыль емкостью в 2 л) смешивают 400 г казеина, 400 мл соляной кислоты и 200 мл дистиллированной воды. Смесь автоклавируют при 127° в течение 3 — 4 час. После автоклавирования гидролизат двукратно разводят дистиллированной водой, фильтруют через полотно или бумагу. Затем объем фильтрата доводят дистиллированной водой до 3 л и осветляют активированным углем. Для этого добавляют 50 г угля на 1 л фильтрата. Смесь кипятят в течение 10 мин. и пропускают через бумажный фильтр. Из указанного выше количества казеина получается примерно 3 л гидролизата, который представляет собой прозрачную жидкость слегка желтоватого цвета. После фильтрации в готовом гидролизате определяют количество аминного азота методом формольного титрования (методика количественного определения аминного азота приводится ниже). Гидролизат можно хранить при комнатной температуре при добавлении 0,5% хлороформа в течение нескольких месяцев.

Методика количественного определения аминного азота

В соответствии с Методическими указаниями МЗ СССР по применению физико-химических методов контроля питательных сред. М., 1977.

Принцип метода основан на блокировании формальдегидом при pH = 7,0 свободных аминогрупп и титровании щелочью эквивалентного количества карбоксильных групп. Начало и конец титрования определяют потенциометрически.

1. Едкий натр 0,1 н раствор

2. Соляная кислота 0,1 н раствор

3. Формалин (40% раствор формальдегида). Перед каждым определением pH формалина доводят до 7,0.

Для анализа используют определенный объем «B» жидкого образца или раствора сухого образца с содержанием аминного азота 1,5 — 5 мг. «B» равно для жидких гидролизатов низкой степени расщепления (0,1 — 0,2% аминного азота) — 3 мл; средней степени расщепления (0,3 — 0,6% аминного азота) — 1 мл; высокой степени расщепления (0,7 — 1,3% аминного азота) — 0,5 мл; для жидких питательных сред (0,08 — 0,14% аминного азота) — 3 мл; для жидких экстрактов (0,02 — 0,04% аминного азота) — 0 мл. При анализе сухих образцов, таких как сухие гидролизаты, сухие питательные среды, сухие экстракты с содержанием аминного азота 1,5 — 4,0% «В» равно 10 мл 1% раствора (анализируемая навеска образца составляет 100 мг).

В стакан емкостью 50 мл наливают объем «В» анализируемого раствора образца и доводят общий объем дистиллированной водой до 20 мл. Электроды потенциометра погружают в исследуемый раствор, pH которого доводят до 7,0 с помощью 0,1 н раствора NaOH или 0,1 н раствора соляной кислоты. Во время определения электроды должны оставаться погруженными в раствор. К нейтрализованному раствору добавляют 2 мл нейтрального формалина, перемешивают и, не вынимая электродов, титруют содержимое 0,1 н раствором едкого натра до pH 9,1. При титровании следует использовать микробюретку на 5 мл.

Содержание аминного азота в исследуемом образце в % вычисляют по формуле:

А — количество 0,1 н раствора NaOH в мл, пошедшее на титрование испытуемой пробы;

K — поправка к титру 0,1 н раствора NaOH;

1,4 — количество аминного азота в м , эквивалентное 1 мл 0,1 н раствора

100 — коэффициент пересчета в проценты;

B — количество жидкого образца в мл, взятое на анализ;

1000 — коэффициент пересчета мг в г.

где С — анализируемая навеска сухого образца в мг, содержащаяся в титрируемом объеме «В».

Остальные обозначения смотри выше.

Приготовление диализата дрожжей

Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1 кг размешивают в 1 л дистиллированной воды до состояния гомогенной массы, которую переливают в целлофановый мешок, предварительно промытый дистиллированной водой. Мешок завязывают, обмывают под струей водопроводной воды, а затем дистиллированной водой и погружают в эмалированную посуду (кастрюля, бак), в которую предварительно наливают 1,3 л дистиллированной воды. Мешок должен быть полностью погружен в воду. Диализ ведут при температуре от 60° до 80° в течение 6 часов (за это время количество воды в кастрюле должно уменьшиться примерно в 2 раза). Затем жидкость из кастрюли переливают в стерильную бутыль.

Для повышения выхода диализата можно повторить диализ этих же дрожжей следующим образом: мешок с дрожжами заливают второй раз таким же количеством дистиллированной воды, предварительно нагретой до 70°; сосуд, в котором проводится диализ, в целях сохранения тепла накрывают ватником и оставляют на ночь. На следующий день жидкость из кастрюли смешивают с первой порцией, добавляя хлороформ (0,5%); сохраняют при температуре от 5° до 7° до 3 месяцев.

Приготовление экстракта дрожжей

Свежие хлебные дрожжи (прессованные) в количестве 1 кг суспензируют в 1 л дистиллированной воды, стерилизуют текучим паром (100 °C) в течение 30 мин., затем отстаивают в холодильнике (+4 °C) в течение 5 — 6 суток. Надосадочную жидкость декантируют (осторожно сливают), разливают во флаконы и вновь стерилизуют при 100 °C в течение 30 минут. Последующее хранение дрожжевого экстракта рекомендуют в холодильнике.

Состав приготовления казеиново-угольного агара

Для приготовления 1 литра среды КУА необходимы следующие ингредиенты:

1. Казеиновый гидролизат — из расчета, чтобы в готовой среде содержалось 130 — 150 мг% аминного азота (расчет количества гидролизата приводится ниже)

3. MgCl — 0,4 г или 2 мл 20% раствора

4. Крахмал растворимый — 1,5 г

5. CaCl — 0,01 г или 1 мл 1% раствора

6. FeSO — 0,01 г или 1 мл 1% раствора

7. CuSO — 0,005 г или 1 мл 0,5% раствора

8. Цистин или цистеин L- и LD-формы — 0,03 г или 2 мл 1,5% раствора

9. Дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт — 100 мл

11. Уголь активированный — 3 г.

Качество питательной среды, приготовленной с новой партией агар-агара, обязательно проверяется по методике, указанной ниже.

Количество гидролизата казеина, которое берут для приготовления казеиново-угольного агара, не является постоянным, а меняется в зависимости от содержания в гидролизате аминного азота. Количество гидролизата, которое следует взять для приготовления среды, определяют следующим образом: если, например, в казеиновом гидролизате содержится 800 мг% аминного азота, а в изготовляемой среде должно содержаться его 150 мг%, то производят расчет:

—————— = 187 мл гидролизата на 1 л среды.

Казеиновый гидролизат и дистиллированную воду (примерно 600 мл) смешивают в эмалированной кастрюле соответствующей емкости и нейтрализуют 20% едким натром до pH 7,0 по бромтимолсинему (до зеленого цвета). Затем вносят навески различных солей по прописи. Крахмал предварительно растворяют в небольшой порции горячей воды и вносят в виде раствора. Агар-агар промывают под струей водопроводной воды в течение нескольких часов или замачивают на 1 — 2 часа и вносят в смесь, после чего кипятят 10 мин. для расплавления агар-агара над пламенем горелки. Затем к смеси добавляют цистин или цистеин, дрожжевой диализат или дрожжевой экстракт. Устанавливают pH ,3 по компаратору (метанитрофенол) и вносят активированный уголь, тщательно перемешивая. Среду разливают во флаконы или пробирки. Стерилизуют при 110° в течение 20 мин. Среду во флаконах после стерилизации охлаждают до 45 — 50°, тщательно перемешивают для равномерного распределения угля и разливают по чашкам, а среду в пробирках после охлаждения и перемешивания скашивают. Оставшуюся впрок среду во флаконах (матрацах) по мере необходимости растапливают в водяной бане или аппарате Коха (текучим паром) до полного расплавления агара. Излишнее прогревание среды не рекомендуется. Готовая среда должна иметь черный цвет, конденсационная вода не должна содержать частиц угля. Среда, разлитая в чашки Петри, хранится в холодильнике в течение недели.

Для улучшения качества питательной среды одновременно с цистином можно добавить 0,03 г на 1 литр ее пролина или глютанина.

Сухой казеиново-угольный агар

В 100 мл дистиллированной воды тщательно размешивают 4,5 — 5,0 г порошка, доводят до кипения, автоклавируют 30 мин. при 110°. Среду перемешивают и разливают в чашки Петри или пробирки. Повторное растапливание среды не рекомендуется. Для улучшения качества казеиново-угольной среды можно добавлять 3 — 5 мл стерильной крови (дифибринированной) барана, лошади, крупного рогатого скота, кролика, человека на 100 мл стерильной остуженной среды. Среду тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри или пробирки. Вместо крови для улучшения роста можно добавить до автоклавирования среды 0,5% активированного угля марки «А» или другой марки одновременно с дрожжевым диализатом или экстрактом (50 мл на 1 л среды), предварительно нейтрализованным (по бромтимоловому синему до зеленого цвета) до pH 7,0.

Методика проверки качества казеиново-угольного агара

В связи с довольно сложным составом казеиново-угольной среды и большой чувствительностью ее к режиму стерилизации следует периодически проверять качество готовой среды. Для этой цели необходимо пользоваться свежевыделенными культурами коклюшного микроба . В стерильных пробирках делают 8 различных разведений взвеси 2 — 3-суточной культуры. Густота взвеси в первой пробирке должна соответствовать 5 млрд. микробных тел в 1 мл по стандарту мутности для коклюшных микробов . Во 2 — 6 пробирки наливают по 4,5 мл стерильного физиологического раствора, в 7-ю наливают 2 мл и в 8-ю — 1 мл. Поверхность одной или двух чашек Петри с используемой средой делят на 2 — 4 или 8 секторов (в зависимости от питательной среды): 0,5 мл взвеси из 1 пробирки переносят стерильной пипеткой во 2 пробирку и этой же пипеткой наносят 0,1 мл взвеси на сектор 1. Другой стерильной пипеткой перемешивают содержимое второй пробирки (вдуванием и выдуванием), переносят из нее 0,5 мл в 3-ю пробирку и 0,1 мл наносят на сектор 2 и т.д. Для каждого разведения следует употреблять отдельную стерильную пипетку, перемешивая ею содержимое пробирки. В 8-ю пробирку переносят из 7-й 1 мл взвеси, также перемешивая стерильной пипеткой, и наносят 0,1 мл на сектор 8.

При отсутствии свежевыделенных культур в лаборатории их можно получить в ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Стеклянный стандарт мутности для оптической стандартизации бактерийных взвесей выпускает ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Чашку Петри осторожно, крышкой кверху (чтобы капли не слились) ставят в термостат и выдерживают в течение 3 — 5 суток. Если среда приготовлена правильно, то на первых трех секторах рост имеет вид сплошных бляшек, на секторах 4, 5 и 6 вырастают тесно расположенные колонии, а на секторах 7 и 8 — небольшое количество изолированных колоний. Если нет роста на последних 2 секторах, то средой пользоваться нельзя.

При использовании питательных сред с добавлением крови чашки Петри делят на 2 сектора, а при использовании сухих сред (КУА) с добавлением дрожжевого экстракта — на 4 сектора.

В районных лабораториях СЭС можно использовать метод проверки качества питательной среды, предложенный Е.А. Кузнецовым. Посев колонии коклюшного микроба производят на 1/16 поверхности чашки со средой КУА, разлитой в чашки Петри. Всего проверяют 5 — 10 колоний. Учет роста культуры проводят через 48 часов. В случае роста культуры по всему сектору — среда хорошего качества, при росте на 1/2 сектора — замедленный рост коклюшного микроба; рост только на посевной площадке — среда плохая.

СХЕМА ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАЗВЕДЕНИЙ КОКЛЮШНОЙ КУЛЬТУРЫ

ДЛЯ ПРОВЕРКИ КАЧЕСТВА КУА

│N пр о- │Кол-во физ.│Объем вносимой взвеси│ Количество микробов │

источник