| Главная »» Методические рекомендации и пособия для врачей »» Лабораторная диагностика синдрома эндогенной интоксикации опубликовано 19.04.2006 (Московское время 19:21) —> версия для печати II. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ 1. ГРУППЫ МЕТАБОЛИТОВ СО СВОЙСТВАМИ ЭНДОГЕННЫХ ТОКСИНОВ В последние годы исследованию синдрома эндогенной интоксикации (ЭИ) отводится важная роль. Показано, что эндотоксемия развивается при всех патологических состояниях, связанных с повышенным катаболизмом или блокадой детоксикационных систем организма. Впервые субстратом, ответственным за возникновение местных патологических эффектов эндогенной интоксикации при почечной недостаточности, считали белковые токсины – среднемолекулярные пептиды (СМП). К числу последних относили эндогенные компоненты, молекулярная масса которых составляла 500-2000 дальтон (Д), образующиеся в процессе протеолиза в поврежденных тканях, а также в самой плазме при выходе в кровь протеолитических ферментов. В дальнейшем было показано, что для многих видов патологий характерно нарушение функционирования протеазной и антипротеазной систем, в результате активации протеолиза происходит накопление большого количества продуктов деградации белков с молекулярной массой 300-5000 Д. В современной отечественной литературе класс среднемолекулярных продуктов протеолиза именуют как молекулы средней массы (МСМ). Химический состав МСМ весьма неоднороден и объединяет гетерогенную группу веществ. Он включает пептиды, гликопептиды, нуклеопептиды, эндорфины, аминосахара, полиамины, многоатомные спирты, некоторые гуморальные регуляторы – инсулин, глюкагон, некоторые витамины, нуклеотиды, олигосахариды, производные глюкуроновых кислот и другие.
В работах В.Н. Титова (2004) высказывается мнение, что при асептическом воспалении эндогенными патогенами являются молекулы белка, которые вышли из цитозоля в межклеточную среду, лимфоток и кровь при нарушении целостности мембран клеток разных органов, в частности, при инфаркте миокарда, системной красной волчанке и ревматоидном артрите это креатинкиназа, ЛДГ, миоглобин и тропонины; а также аутоиммунные комплексы, сформированные во внутрисосудистом пуле, и макромолекулы белка, физиологичные компоненты сыворотки крови, которые имеют афизиологичную конформацию (пространственную, стерическую форму молекулы).
По мнению В.Н. Титова (2004), эндогенными патогенами – инициаторами воспаления при атеросклерозе, по-видимому, являются модифицированные в ходе окислительного стресса (физиологично денатурированные) липидтранспортные макромолекулы – липопротеины.
Практически при любой патологии и любом неблагоприятном (стрессовом) воздействии на организм активируются процессы свободнорадикального окисления, что приводит к накоплению токсических веществ, которые относят к эндотоксинам. Повышение в сыворотке крови содержания продуктов ПОЛ, а также увеличение активности ферментов детоксикации активных форм кислорода являются неспецифическими тестами эндотоксикоза. Показано, что продукты распада липидов (альдегиды, диальдегиды, эпоксиды) оказывают повреждающее действие на различные структуры клетки, белки, нуклеиновые кислоты и другие структуры, следовательно, являются эндопатогенами.
Перекисное повреждение белковых веществ приводит к их деградации и образованию токсических фрагментов, в том числе, молекул средней массы.
При гемолитической анемии и усилении спонтанного гемолиза эндогенным патогеном становится комплекс гаптоглобин + гемоглобин сыворотки крови.
К эндогенным токсинам также относят большую группу химических веществ, включающую не только токсины липидов, но – и недоокисленные продукты обмена, кинины, катехоламины, альдегиды, кетонины, биогенные амины и другие. Молекулярная масса эндогенных патогенов колеблется в широких пределах. Молекулярная масса патогенов, которые переходят из межклеточного пула во внутрисосудистый, например, миоглобин и тропонин, не превышает 60 кД. Однако большая часть токсинов принадлежит к МСМ.
В группу СМП входят вазопрессин, окситоцин, ангиотензин, АКТГ, глюкагон, кальцитонин, липофусцин (внутриклеточные комплексы липидов и белков), атерогенно окисленные липопротеины и многие другие.
Среди широкого круга метаболитов, обладающих способностью оказывать эндотоксическое действие, заслуживает внимания группа веществ, которые образуются в результате распада белков в кишечнике под действием патогенной микрофлоры, а именно, фенолы, индолы, аммиак, меркаптаны. Сюда же относятся токсины, являющиеся продуктами распада гельминтов при гельминтозах; токсины микробов, например, грамотрицательных бактерий, которые являются продуцентами эндотоксинов. Последние представляют собой высокомолекулярный полисахаридный комплекс, локализованный на наружной мембране бактерий и попадающий во внешнюю среду при их разрушении. Они способны оказывать на организм токсический и аллергический эффекты. Медиаторы утомления у спортсменов относят к СМП.
По мнению ряда исследователей, все МСМ следует разделить по свойствам растворимости. Считается, что водорастворимые токсины – это МСМ, которые фильтруются почками, и их содержание в крови зависит от функциональной полноценности почек и скорости образования токсинов. В среднем, до 80 % МСМ этой группы с молекулярной массой от 500 до 5000 Д принадлежат продуктам нарушенного белкового обмена, до 20 % — относятся к биологически активным веществам и соединениям промежуточного обмена.
Гидрофобные токсины, которые обладают высоким сродством к биологическим структурам, находятся в плазме практически полностью в связанном состоянии в виде комплексов с альбумином и липопротеинами низкой плотности, и их считают наиболее токсичными. Обнаружено, что во фракции МСМ липиды в крови доноров составляют в среднем 25 % всего пула. Жирорастворимые токсины могут переноситься кровью в связанном с белками комплексе, причем, основным их переносчиком является альбумин. Поэтому, при изменении физико-химических свойств крови конформационная структура молекул альбумина может изменяться, что отразится на его связывающей способности. Элиминируется эта группа токсинов печенью.
Липофильные молекулы токсинов способны проникать через билипидный слой клеточных мембран, нарушать их целостность, и тем самым, влиять на ток ионов и внутриклеточный метаболизм. К токсинам, связывающимся с молекулой альбумина, относят уробилин, жирные кислоты, некоторые лекарственные вещества и другие.
Окисление макромолекул белка (эндогенных патогенов) в плазме крови направлено на их физиологическую денатурацию, формирование на поверхности молекул белка патологических эпитопов, которые далее служат «сигналом» для опсонизации и последующего удаления денатурированных молекул путем фагоцитоза их оседлыми (резидентными) макрофагами. Физиологическая денатурация макромолекул белка (эндогенных патогенов) происходит в крови, вне нейтрофилов.
Эндогенные токсины являются макромолекулами протеина, которые выходят в кровь при деструкции клеток, не являются нормальными компонентами плазмы крови и подлежат удалению из кровотока.
В настоящее время показано, что в нормальных условиях 95 % МСМ удаляются, главным образом, путем гломерулярной фильтрации. Основная масса МСМ расщепляется, инактивируется или частично разрушается внутри проксимальных тубул почек, и свободные аминокислотные остатки реабсорбируются через нормальную транспортную систему.
Причиной накопления содержания МСМ в сыворотке крови при ряде заболеваний при сохранении нормального уровня гломерулярной фильтрации является усиленное образование их за счет появления избыточного количества афизиологических метаболитов. При хронической почечной недостаточности одной из причин повышения уровня МСМ может быть недостаточность полного катаболизма МСМ. 2. БИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ МОЛЕКУЛ СРЕДНЕЙ МАССЫ Существенная особенность МСМ заключается в их отчетливо выраженной высокой биологической активности. Накопление МСМ не только является маркером эндоинтоксикации, в дальнейшем они усугубляют течение патологического процесса, приобретая роль вторичных токсинов, оказывая влияние на жизнедеятельность всех систем и органов. Несмотря на большое количество работ, окончательно пул СМП не идентифицирован, однако, точно установлено, что состав МСМ включает в себя компоненты пептидной природы, а также производные олигоспиртов и глюкуроновой кислоты.
К настоящему времени достаточно подробно изучено биологическое действие МСМ. Многие из них обладают нейротоксической активностью, угнетают процессы биосинтеза белка, способны подавлять активность ряда ферментов, разобщают процессы окисления и фосфорилирования, нарушают механизмы регуляции синтеза адениловых нуклеотидов, изменяют транспорт ионов через мембраны, эритропоэз, фагоцитоз, микроциркуляцию, лимфодинамику, вызывают состояние вторичной иммунодепрессии. СМП способны соединяться и блокировать рецепторы любой клетки, неадекватно влияя на её метаболизм и функции. Показана возможность влияния МСМ на тонус гладкомышечных клеток, на трансваскулярный транспорт. Эти вещества могут взаимодействовать с компонентами систем гемостаза. Считается, что МСМ могут проникать через плацентарный барьер, оказывая непосредственное токсическое влияние на плод, вызывая полиорганные нарушения разного характера. Токсическое влияние могут оказывать накапливающиеся в нефизиологических концентрациях промежуточные и конечные продукты нормального и нарушенного обмена. Показана антиоксидантная роль СМП.
В результате исследования МСМ было установлено повышение их уровня в плазме и сыворотке крови при различных патологических состояниях разной степени тяжести: при шоке различной этиологии, сепсисе, злокачественных новообразованиях, ожоговой болезни, травмах, остром панкреатите и панкреонекрозе, диабете и при диабетических поражениях сосудов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки, ишемии органов и тканей, менингите, ряде хирургических заболеваний (перитоните, панкреатите), заболеваниях сердечно-сосудистой и респираторной систем, у больных с разными формами инсульта, нарушении процессов свертываемости крови, при развитии аритмии, поражениях суставов, ревматоидном артрите, вибрационной болезни, генитальном эндометриозе, ожогах и др.
Накопление в крови недоокисленных продуктов метаболизма, патогенов отмечается при инфекционных заболеваниях, при этом нарушается целостность клеток хозяина, в кровь выходят функционально «закрытые» антигены и в организме начинается наработка против них аутоантител, которые являются факторами формирования эндогенных патогенов, аутоиммунных комплексов. Последние можно удалить из кровотока только путем фагоцитоза, активируя сначала их физиологическую денатурацию.
Основными механизмами повышенного образования МСМ у больных Астраханской риккетсиозной лихорадкой по мнению А.А. Николаева с соавт. (1999) является массивное разрушение эндотелия и выход содержимого клеток в кровяное русло, а затем ДВС-подобная дискоагуляция, пополняющая фракцию МСМ промежуточными продуктами протеолиза, и иммунные реакции. Показано однонаправленное повышение содержания СМП в плазме с максимумом в период разгара болезни при гриппе, вирусных гепатитах, дизентерии, ангинах.
Образование эндотоксинов различной биологической активности зафиксировано при снижении двигательной активности, которое приводит к застойным явлениям в капиллярах, гипоксии и нарушению процессов аэробного окисления; при нарушении эвакуаторной функции кишечника, частых запорах, а также хронических воспалительных процессах в почках.
Велика диагностическая ценность определения уровня веществ средней и низкой молекулярной массы в плазме новорожденных детей, перенесших внутриутробную гипоксию.
Наряду с этим показано, что в начале соревновательного периода у высококвалифицированных спортсменов отмечалось снижение уровня МСМ, в то время как у менее квалифицированных наблюдался прирост этих веществ в крови.
У пожилых людей выявлено наличие токсиконемии на фоне хороших показателей основных параметров гомеостаза, таких как ЛИИ, общий белок, креатинин, АЛТ, ACT. В то же время, исследованиями А.Н. Ковалевского, О.Е. Нифантьева (1989) не выявлено значительных различий в концентрации МСМ в сыворотке крови доноров по возрасту и по группе крови.
При острых отравлениях психотропными препаратами показано увеличение СПМ в 1,5 раза.
Диагностическое значение этих веществ велико как при воспалениях разного характера, так и при токсикозах разного происхождения. Таким образом, на сегодняшний день интоксикацию организма рассматривают как один из наиболее важных критериев, определяющих тяжесть состояния человека и животных. Уровень СМП чаще измеряют в плазме и сыворотке, реже – в эритроцитах, тромбоцитах, моче и слюне. По мнению А.И. Ковалевского, О.Е. Нифантьева (1989) определение МСМ лучше проводить в цельной крови.
Установлено, что у ликвидаторов аварии на Чернобыльской АЭС, страдающих ИБС, по сравнению с необлученными больными ИБС, наблюдаются более глубокие изменения содержания общего пула и перераспределения отдельных фракций ВСНММ в эритроцитах, тромбоцитах и плазме крови. Показано, что у нейрохирургических больных (при тяжелом течении болезни, особенно, при наличии гнойно-асептических осложнений) процент соединений липидной природы СМП возрастает с большей скоростью, чем общий уровень МСМ.
Для диагностики поражений почек используют определение уровня средних молекул в моче. Нами показано, что эндогенная интоксикация имеет место как при гломерулонефрите, так и при изолированной микрогематурии, максимально выражена она в активную фазу гломерулонефрита, при этом наиболее информативным методом ее диагностики являются определение веществ низкой и средней молекулярной массы, детектируемых при длинах волн 238-310 нм в моче. В моче обнаружено наибольшее повышение концентрации веществ средней молекулярной массы, детектируемых при длине волны 243 нм. У детей, проживающих в условиях повышенной антропогенной нагрузки, развиваются выраженные клинические проявления эндотоксикоза. При этом в моче этих детей общее количество ВСНММ увеличивается в 3,2 раза. 3. БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ СО СВОЙСТВАМИ ЭНДОГЕННЫХ ТОКСИНОВ. УРОВНИ ДИАГНОСТИКИ В настоящее время существует много способов выявления эндогенной интоксикации с помощью гематологических, биохимических, биофизических, микробиологических, иммунологических методов и методов биологического тестирования.
К биохимическим показателям относят исследования:
1) компонентов и медиаторов воспаления,
2) метаболитов, характеризующих виды обмена и функции
жизненно важных органов,
3) компонентов перекисного окисления липидов (ПОЛ) и антиоксидантной защиты (АОС),
4) традиционных показателей эндогенной интоксикации – креатинина, мочевины, индикана, мочевой кислоты,
5) веществ низкой и средней молекулярной массы (ВСНММ).
Представляется целесообразным выделить три уровня биохимической диагностики синдрома эндогенной интоксикации.
Первый уровень
Метаболиты, характеризующие виды обмена и функции жизненно важных органов. Традиционные показатели эндогенной интоксикации – креатинин, мочевина, индикан, мочевая кислота.
Второй уровень
Вещества низкой и средней молекулярной массы.
Третий уровень
Компоненты и медиаторы воспаления, компоненты перекисного окисления липидов и антиоксидантной защиты. В то же время, по мнению М.Я. Малаховой (1995), все методы лабораторной диагностики интоксикации можно разделить на: специфические, условно-специфические и неспецифические.
1. Специфические позволяют выявить действие токсических агентов, вызывающих синдром интоксикации: выделение конкретного токсического агента; метод биотестирования; реакция клапанного аппарата лимфатического сосуда брыжейки кишки; парамецийный тест; тетрахименовый тест; тест с семенным материалом быка; лимулис-тест; биомикроскопия конъюнктивы глаза; подвижность ядер буккального эпителия в электрическом поле.
2. Условно специфические позволяют выявить интоксикацию на клетках крови – эритроцитах и лейкоцитах: угнетение миграции лейкоцитов; фрагментация ядра лейкоцитов; реакция везикулообразования; реакция спонтанного лизиса лейкоцитов; НСТ-тест; катионно-лизосомальный тест; лейкоцитарный индекс интоксикации (ЛИИ); токсикогенная зернистость нейтрофилов; тест осмотической резистентности эритроцитов; тест на способность эритроцитов сорбировать метиленовый синий; тест токсической зернистости эритроцитов; оценка ВНСММ и олигопептидов эритроцитов по М.Я. Малаховой.
3. Неспецифические отражают либо воспалительную реакцию организма, либо изменения метаболизма: показатель лабораторный (Марчук и др.); индекс интоксикации: Гринева и др., Шугаева,
М.Я. Малаховой и др.; МСМ по Н.И. Габриэлян; ВСНММ по М.Я. Малаховой; олигопептиды по М. Глинскому; олигопептиды по Лоури; регистрация сверхмедленных колебаний потенциалов в
милливольтовом секундном и декасекундном диапазонах; уровень мочевины в биологических жидкостях; уровень плазменного фибронектина и церулоплазмина. 4. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ВЕЩЕСТВ НИЗКОЙ И СРЕДНЕЙ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ Методы, позволяющие определить ВСНММ разнообразны:
— Методы ультрафильтрации через мембраны, имеющие строго определенный размер пор;
— методы гель-фильтрации на различных носителях;
— метод жидкостной хроматографии под высоким давлением;
— спектрометрические методы определения пула ВСНММ и
олигопептидов, остающихся в растворе после осаждения крупномолекулярных.
Работы по изучению показателей эндотоксикоза при различных состояниях организма продолжаются и, по мнению ряда исследователей, высокоинформационными тестами оценки токсемии являются такие как
1) определение молекул средней массы по Н.И. Габриэлян,
2) определение ВСНММ по М.Я. Малаховой,
3) определение общего уровня олигопептидов и их фракций,
4) содержание тирозинсодержащих пептидов в плазме крови,
5) показатель «эффективной концентрации альбумина» (ЭКА),
6) определение связывающей способности альбумина (ССА),
7) определение резерва связывания альбумина (РСА),
8) определение содержания С-реактивного белка (СРБ),
9) определение модифицированных липопротеинов (липидтранспортных макромолекул),
10) определение доли липидных фракций МСМ по В.Ш. Промыслову и др.,
11) определение иммунных комплексов,
12) определение содержания эндогенных аутологичных патогенов. В настоящее время методы определения веществ (ВСНММ) являются общепризнанными критериями ЭИ. О содержании среднемолекулярных пептидов можно судить на основании прямой спектрометрии депротеинизированного супернатанта, полученного после осаждения белков раствором ТХУ при длинах волн 254 нм и 280 нм. Однако, по мнению В.В. Николайчика и др. (1991), для повышения точности метода белки вернее осаждать хлорной кислотой вместо ТХУ и проводить доосаждение высокомолекулярных примесей с помощью 80 % этанола.
Показатель Д254 рассматривается как интегральный критерий содержания УФ-поглощающих веществ низкой и средней молекулярной массы от 500 до 5000 Д, к которым, кроме пептидов относят около 200 соединений нормального и аномального метаболизма.
Согласно рекомендации М.Я. Малаховой (1995), суммарное содержание ВСНММ необходимо оценивать по площади под спектральной кривой оптического поглощения пробы в области 238-300 нм.
В последние годы предложен более чувствительный новый тест в диагностике интоксикации организма, и он не только более точный, но и простой, и заключается в определении концентрации тирозин-содержащих пептидов.
Так как эндогенная интоксикация может быть вызвана не только увеличением содержания каких-то конкретных веществ, но и нарушением равновесия между отдельными компонентами пула ВСНММ, было предложено рассчитывать коэффициенты, представляющие собой соотношение экстинкций на определенных длинах волн. Следовательно, характер физиологических и патологических процессов in vivo может быть определен не только по количественным изменениям специфических протеинов биологической среды, но и по их соотношению, что может дать дополнительную интегральную информацию о состоянии систем организма. Первым был предложен коэффициент Д280 / Д254, так называемый коэффициент распределения. Однако исследованиями А.Н. Ковалевского, О.Е. Нифантьева (1989) установлено, что показания этого коэффициента не всегда коррелировали с состоянием больного.
Далее были предложены другие коэффициенты: пептидно-нуклеотидного распределения и коэффициент ароматичности. Пептидно-нуклеотидный коэффициент рассчитывается по формуле соотношения экстинкций Д238 / Д260, который указывает на соотношение сдвигов в содержании пептидов и нуклеотидов в пуле ВСНММ. Коэффициент ароматичности рассчитывается по формуле Д238 / Д280 и свидетельствует о вкладе пептидов, не содержащих ароматичных хроматофоров, о соотношении хроматофоров ароматической и неароматической природы. Однако, эти данные не вызвали должного интереса.
В качестве показателя уровня эндогенной интоксикации предложено использовать:
— индекс токсичности, рассчитанный по соотношению содержания общей концентрации альбумина (ОКА) к концентрации ЭКА,
— коэффициент эндогенной интоксикации, рассчитанный по
формуле КЭИ= СМП/ЭКА* 1000
В последние годы все чаще используются исследования данных коэффициентов при ряде заболеваний.
В качестве основных показателей механизма детоксикации организма рекомендуют использовать сорбцию гидрофобных токсинов альбумином и липопротеинами плазмы. Это обусловлено тем, что альбумин, полифункциональный кислый белок, способен связывать эндо- и экзотоксины, приостанавливая их поступление в ткани. Низкое содержание этого белка создает условия для проникновения эндопатогенов в ткань и реализации их негативного воздействия.
Показано, что на ранних стадиях эндогенной интоксикации уровень СМП возрастает по сравнению с нормой в среднем на 20-30 %, на средней стадии — на 100-200 %, поздних — на 300-400 %. источник В норме содержание молекул средней массы (средних молекул) в крови составляет 0,240±0,04 усл.ед. Средние молекулы (СМ) — эндогенные компоненты, молекулярная масса которых составляет 500—5000 дальтон. Название «средние молекулы» основано на общности группового признака — величине молекулярной массы. Они занимают промежуточное (среднее) положение по своей молекулярной массе между простыми веществами в сыворотке крови (мочевина, креатинин, билирубин и т.д.) и белками. Химический состав группы СМ весьма неоднороден. Она включает пептиды, гликопептиды, аминосахара, полиамины, многоатомные спирты и др. Группа СМ состоит по меньшей мере из 30 пептидов с установленной биологической активностью. Среди них вазопрессин, окситоцин, нейротензин, ангиотензин, АКТГ, глюкагон, кальцитонин, эндорфины, энкефалины и др. Значительная часть СМ образуется в процессе катаболизма белков в организме. Существенная особенность СМ заключается в их высокой биологической активности. Средние молекулы обладают нейротоксической активностью, угнетают процессы биосинтеза белка, способны подавлять активность ряда ферментов, разобщать процессы окисления и фосфорилирования, вызывать состояния вторичной иммунодепрессии, оказывать токсическое действие на эритропоэз. Обладая относительно небольшой молекулярной массой, в норме СМ удаляются из организма почками путем клубочковой фильтрации. Так удаляется 95 % СМ, которые у здорового человека затем почти полностью реабсорбируются клетками проксимальной части ка-нальцевой системы нефрона. Со стороны просвета канальца в щеточной каемке имеются активные пептидазы, которые быстро гидролизуют пептиды, и образовавшиеся аминокислоты реабсорбируются в кровь. Снижение функциональной способности почек к удалению СМ приводит к тому, что при почечной недостаточности может наступить гипергастринемия, избыток в крови паратгормона, а вследствие замедления инактивации инсулина в почках у больных диабетом может снижаться потребность в инсулине. Вот почему накопление СМ в организме при почечной недостаточности во многом определяет многообразие клинических проявлений эндотоксикоза (сомноленция, «неуправляемая» гипертензия, анемия, псевдодиабет, рвота, диарея, уремическая остеопатия и др.). В последние годы показано важное значение СМ в патогенезе ряда заболеваний: уремической интоксикации, печеночной комы, острой ожоговой токсемии, перитоните, остром панкреатите, инфаркте миокарда, обострении туберкулеза, ревматизма, онкологических заболеваний. Повышение уровня СМ в сыворотке крови зависит от состояния больных. Предельно высокие значения уровня СМ (0,8—0,9 усл. ед. и выше) отмечаются у лиц с острой и хронической почечной недостаточностью; средние значения (0,4—0,8 усл. ед.) — у больных с печеночной комой, разлитым гнойным перитонитом, острым панкреатитом, тромбоэмболическими осложнениями, сепсисом, ожоговой токсемией; низкие (0,3—0,4 усл. ед.) — у больных после хирургических вмешательств (аппендэктомия, холецистэктомия), у лиц с черепно-мозговой травмой, при местном перитоните, онкологических заболеваниях, у больных с нарушениями мозгового кровообращения [Кишкун А.А. и др., 1990]. У истощенных больных даже при наличии разлитого гнойного перитонита увеличения уровня СМ в крови не выявляется. При эндогенной интоксикации наблюдается прямая связь между увеличением уровня СМ и ухудшением состояния больного. Стойкое повышение уровня СМ у больных с ОПН, несмотря на улучшение прочих показателей (креатинин, мочевина, калий), является признаком неблагоприятного исхода заболевания. Динамическое исследование больных, находящихся в реанимационных отделениях, показывает, что нарастание явлений эндогенной интоксикации во всех случаях наблюдается на фоне увеличения уровня СМ, которое является одним из ранних признаков развития осложнений. Эффективность специфической и детоксикационной терапии отражает величина СМ. У всех больных уменьшение клинических проявлений эндотоксикоза сопровождается уменьшением уровня СМ. На основе анализа клинических данных и результатов лабораторных исследований разработана схема [Габриэлян Н.И., 1983] оценки тяжести уремической интоксикации у больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (табл. 4.15). При первой стадии ХПН лечение, как правило, ограничивается специфической лекарственной терапией, аиспользование сеансов гемодиализа вызывает отчетливый и продолжительный эффект. Вторая и третья стадии ХПНсоответствуют выраженной и высокой степени эндотоксикоза. Успешное лечение таких больных возможно лишь при использовании программного гемодиализа, а также аллотрансплантации почки. При четвертой стадии интоксикации современные средства лечения не приводят к радикальному улучшению состояния. Определение уровня СМ до проведения лечебной гемосорбции, плазмафереза, гемодиализа ипосле них позволяют количественно оценивать эффективность проводимых мероприятий. Т а бл и ц а 4.15. Оценка тяжести уремической интоксикации у больных с ХПН источник В норме содержание молекул средней массы (средних молекул) в крови составляет 0,240±0,04 усл.ед. Средние молекулы (СМ) — эндогенные компоненты, молекулярная масса которых составляет 500—5000 дальтон. Существенная особенность СМ заключается в их высокой биологической активности. Средние молекулы обладают нейротоксической активностью, угнетают процессы биосинтеза белка, способны подавлять активность ряда ферментов, разобщать процессы окисления и фосфорилирования, вызывать состояния вторичной иммунодепрессии, оказывать токсическое действие на эритропоэз. Обладая относительно небольшой молекулярной массой, в норме СМ удаляются из организма почками путем клубочковой фильтрации. Так удаляется 95 % СМ, которые у здорового человека затем почти полностью реабсорбируются клетками проксимальной части ка-нальцевой системы нефрона. Со стороны просвета канальца в щеточной каемке имеются активные пептидазы, которые быстро гидролизуют пептиды, и образовавшиеся аминокислоты реабсорбируются в кровь. Снижение функциональной способности почек к удалению СМ приводит к тому, что при почечной недостаточности может наступить гипергастринемия, избыток в крови паратгормона, а вследствие замедления инактивации инсулина в почках у больных диабетом может снижаться потребность в инсулине. Вот почему накопление СМ в организме при почечной недостаточности во многом определяет многообразие клинических проявлений эндотоксикоза (сомноленция, «неуправляемая» гипертензия, анемия, псевдодиабет, рвота, диарея, уремическая остеопатия и др.). В последние годы показано важное значение СМ в патогенезе ряда заболеваний: уремической интоксикации, печеночной комы, острой ожоговой токсемии, перитоните, остром панкреатите, инфаркте миокарда, обострении туберкулеза, ревматизма, онкологических заболеваний. Повышение уровня СМ в сыворотке крови зависит от состояния больных. Предельно высокие значения уровня СМ (0,8—0,9 усл. ед. и выше) отмечаются у лиц с острой и хронической почечной недостаточностью; средние значения (0,4—0,8 усл. ед.) — у больных с печеночной комой, разлитым гнойным перитонитом, острым панкреатитом, тромбоэмболическими осложнениями, сепсисом, ожоговой токсемией; низкие (0,3—0,4 усл. ед.) — у больных после хирургических вмешательств (аппендэктомия, холецистэктомия), у лиц с черепно-мозговой травмой, при местном перитоните, онкологических заболеваниях, у больных с нарушениями мозгового кровообращения [Кишкун А.А. и др., 1990]. У истощенных больных даже при наличии разлитого гнойного перитонита увеличения уровня СМ в крови не выявляется. При эндогенной интоксикации наблюдается прямая связь между увеличением уровня СМ и ухудшением состояния больного. Стойкое повышение уровня СМ у больных с ОПН, несмотря на улучшение прочих показателей (креатинин, мочевина, калий), является признаком неблагоприятного исхода заболевания. Динамическое исследование больных, находящихся в реанимационных отделениях, показывает, что нарастание явлений эндогенной интоксикации во всех случаях наблюдается на фоне увеличения уровня СМ, которое является одним из ранних признаков развития осложнений. Эффективность специфической и детоксикационной терапии отражает величина СМ. У всех больных уменьшение клинических проявлений эндотоксикоза сопровождается уменьшением уровня СМ. На основе анализа клинических данных и результатов лабораторных исследований разработана схема [Габриэлян Н.И., 1983] оценки тяжести уремической интоксикации у больных с хронической почечной недостаточностью (ХПН) (табл. 4.15). При первой стадии ХПН лечение, как правило, ограничивается специфической лекарственной терапией, а использование сеансов гемодиализа вызывает отчетливый и продолжительный эффект. Вторая и третья стадии ХПН соответствуют выраженной и высокой степени эндотоксикоза. Успешное лечение таких больных возможно лишь при использовании программного гемодиализа, а также аллотрансплантации почки. При четвертой стадии интоксикации современные средства лечения не приводят к радикальному улучшению состояния. Определение уровня СМ до проведения лечебной гемосорбции, плазмафереза, гемодиализа и после них позволяют количественно оценивать эффективность проводимых мероприятий. Т а б л и ц а 4.15. Оценка тяжести уремической интоксикации у больных с ХПН источник И Н С Т Р У К Ц И Я По выполнению практической работы № 65 по теме «Химия крови. Определение уровня средних молекул в сыворотке крови». Цели занятия: 1. Закрепить теоретические знания по темам «Химия крови» и «Химия белка». 2. Закрепить умения и навыки в работе с реактивами, оборудованием, посудой. 3. Провести биохимическое исследование – определение уровня средних молекул в сыворотке крови. Исходный уровень знаний и умений. 1. Понятие о крови как единой биохимической системе в организме человека. 2. Основные компоненты крови, их биологическую роль. 3. Патологию обмена белков: изменения уровня белка и/или остаточного азота в крови (гипо- и гиперпротеинемии, азотемии). 4. Патологические состояния, наблюдаемые в биохимической картине крови. 5. Роль лабораторной диагностики в исследовании крови как важнейшего источника сведений о состоянии здоровья человека. 1. Работать с химической посудой, пипетками, дозатором и др. 2. Работать с центрифугой, на спектрофотометре. 3. Приготовить необходимые реактивы и растворы для биохимического исследования. 4. Провести биохимическое исследование по предложенной методике. 5. Дать начальную интерпретацию полученному результату. Структура занятия. 1. Теоретическая часть: Повторение теоретического материала по темам «Химия крови» и «Химия белка». К числу веществ белковой природы, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой и по этой причине могущих быть отнесёнными к компонентам остаточного азота, причисляют в настоящее время так называемые молекулы средней массы, или средние молекулы. Интерес к исследованию этих молекул определяется тем, что они – важные универсальные факторы интоксикации. Химическая природа среднемолекулярных токсинов до сих пор точно не установлена. Известно, что они представляют собой олигопептиды с высоким содержанием дикарбоновых аминокислот, цистеина, лизина и глицина и низким содержанием ароматических аминокислот. Оказывающие токсический эффект молекулы средней массы были выделены из диализной жидкости больных с хронической почечной недостаточностью. Среднемолекулярные пептиды включают в себя гормоны, нейропептиды, медиаторы иммунного ответа и многие другие продукты белкового обмена, в целом определяющие высокую биологическую активность среднемолекулярных пептидов. Если вначале к среднемолекулярным пептидам относили лишь простые и сложные пептиды, гликопептиды и нуклеопептиды, то в настоящее время – некоторые гуморальные регуляторы, в том числе инсулин, глюкагон, различные «тропины» и их комплексы, некоторые витамины, нуклеотиды и др. Значительную часть средних молекул составляют продукты распада фибрина, витамины, поступающие в кровь из ЖКТ, а также метаболиты, образующиеся в процессе распада эндогенных белков. Состав среднемолекулярных пептидов различен в зависимости от вида патологии, характера осложнений. Концентрация средних молекул в плазме может зависеть от развития инфекции, уровня гипергидратации, особенностей лекарственной терапии и диеты. Для выделения из плазмы (сыворотки) крови средних молекул с успехом могут быть использованы способы ультрафильтрации на мембранах, гель-фильтрация на колонках, заполненных сефадексом G-15, а также методы, базирующиеся на различии в растворимости отдельных компонентов среднемолекулярных пептидов в спиртах и способности молекул средней массы не осаждаться трихлоруксусной кислотой. В клинической практике доступными являются скрининговый метод (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974) и модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях. 2. Указания к занятию. Методические рекомендации: Внимательно изучите инструкцию. Приготовьте всё необходимое оборудование, реактивы для проведения анализа. Осмыслите ход выполнения лабораторной работы. Соблюдайте меры предосторожности в работе с реактивами, био-логическим материалом, на спектрофотометре. При работе с градуированной пипеткой используйте резиновую грушу с передником. Соблюдайте дезинфекционный режим в работе. Практическая часть. Лабораторная работа: «Определение уровня средних молекул в сыворотке крови». a) Скрининговый метод определения уровня средних молекул (модификация А. Бабеля с соавторами, 1974). ПРИНЦИП: Метод основан на освобождении сыворотки (или плазмы) крови от содержащихся в ней высокомолекулярных пептидов и белков с использованием ТХУ и количественном определении в полученной после центрифугирования надосадочной жидкости уровня среднемолекулярных пептидов по поглощению в монохроматическом световом потоке при длине волны 254 нм. Реактивы: раствор ТХУ (100 г/л). Хранится в посуде из тёмного стекла при 4-10°C. Готовится путём разбавления дистиллированной водой более концентрированного раствора (500 г/л). Оборудование: спектрофотометр, позволяющий измерять оптическую плотность в ультрафиолетовой области спектра (250-260 нм) с использованием стандартных прямоугольных кварцевых кювет с длиной оптического пути 1 см; центрифуга; пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки. Материал для исследования: сыворотка (плазма) крови или моча. Ход определения. В центрифужную пробирку вносят 1,0 мл сыворотки (или мочи) и 0,5 мл ТХУ. После перемешивания содержимого производят центрифугирование при 3000 об/мин. в течение 30 мин. Отбирают 0,5 мл надосадочной жидкости и переносят в пробирку с 4,5 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают и фотометрируют при длине волны 254 нм, используя в качестве контрольной пробы дистиллированную воду. Результаты выражают в условных единицах, представляющих собой показатели оптической плотности, учтённые с точностью до третьего знака после запятой. Референтные пределы: уровень среднемолекулярных пептидов в пробах сыворотки крови – 0,240 ± 0,02 ед., в пробах мочи – 0,319 ± 0,15 ед. Примечание: При исследовании мочи рекомендуется разводить субстрат дважды, т.е. из 5 мл первоначально поученного раствора отбирать 0,5 мл с последующим внесением этого объёма к 4,5 мл дистиллированной воды. б) Модифицированный способ определения веществ группы средних молекул в биологических жидкостях. ПРИНЦИП: Метод основан на осаждении высокомолекулярных белков плазмы крови действием хлорной кислоты и этилового спирта с последующей фотометрией при длине волны 210 нм. Реактивы: 1,2 моль/л раствора хлорной кислоты (13,8 мл хлорной кислоты х.ч. довести дистиллированной водой до 100 мл); 2 моль/л раствора калия углекислого; 96% раствор этилового спирта. Оборудование: центрифуга; спектрофотометр (позволяющий выделить длину волны 210 нм); пробирки; пробирки центрифужные; штатив; пипетки; ледяная баня. Материал для исследования: плазма или сыворотка крови. Ход определения. В центрифужную пробирку помещают 0,5 мл плазмы (сыворотки) крови, добавляют 0,5 мл хлорной кислоты (реактив I), тщательно перемешивают встряхиванием, оставляют при комнатной температуре на 10-15 мин., затем центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,5 мл центрифугата в пробирку, в которую добавляют 0,1 мл раствора углекислого калия (реактив II). Пробирку выдерживают в ледяной бане в течение 20 мин. Пробу центрифугируют при 3000 об/мин. в течение 10-15 мин. Отбирают 0,2 мл надосадочной жидкости в центрифужную пробирку, добавляют 0,8 мл этанола, встряхивают, оставляют на 10 мин. при комнатной температуре, затем центрифугируют 10 мин. при 3000 об/мин. (для осаждения высокомолекулярных примесей). Отбирают 0,5 мл центрифугата и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды. Перемешивают. Фотометрируют при длине волны 210 нм относительно контрольной пробы. К о н т р о л ь н а я п р о б а: 0,2 мл дистиллированной воды и 0,8 мл этилового спирта; отбирают 0,5 мл этого раствора и добавляют 4,5 мл дистиллированной воды. Расчёт: Показатель оптической плотности пробы при длине волны 210 нм умножают на 3,94 – коэффициент пересчёта результата (в г/л) с учётом разведения биологической жидкости. Референтные пределы: концентрация средних молекул в плазме крови у практически здоровых взрослых людей – 0,53 ± 0,02 г/л. Не нашли, что искали? Воспользуйтесь поиском: источник Почечная (истинная) протеинурия бывает функциональной и органической. Среди функциональной почечной протеинурии наиболее часто наблюдаются следующие ее виды: — физиологическая протеинурия новорожденных, которая исчезает на 4— 10-й день после рождения, а у недоношенных несколько позже;
— ортостатическая альбуминурия, которая характерна для детей в возрасте 7—18 лет и появляется только в вертикальном положении тела;
— транзиторная (инсультная) альбуминурия, причиной которой могут быть различные заболевания органов пищеварения, тяжелая анемия, ожоги, травмы или физиологические факторы: тяжелая физическая нагрузка, переохлаждение, сильные эмоции, обильная, богатая белком пища и др. Органическая (почечная) протеинурия наблюдается вследствие прохождения белка из крови через поврежденные участки эндотелия почечных клубочков при заболеваниях почек (гломерулонефрит, нефроз, нефросклероз, амилоидоз, нефропатия беременных), расстройствах почечной гемодинамики (почечная венная гипертензия, гипоксия), трофических и токсических (в том числе лекарственных) воздействиях на стенки капилляров клубочков. Большинство качественных и количественных методов определения белка в моче основаны на его коагуляции в объеме мочи или на границе сред (мочи и кислоты). Среди качественных методов определения бедка в моче наибольшее распространение получили унифицированная проба с сульфосалициловой кислотой и кольцевая проба Геллера. Унифицированная проба с сульфасалициловой кислотой проводится следующим образом. В 2 пробирки наливают по 3 мл профильтрованной мочи. В одну из них прибавляют 6—8 капель 20 % раствора сульфасалициловой кислоты. На темном фоне сравнивают обе пробирки. Помутнение мочи в пробирке с сульфасалициловой кислотой указывает на наличие белка. Перед исследованием необходимо определить реакцию мочи, и если она щелочная, то подкислить 2—3 каплями 10 % раствора уксусной кислоты. Проба Геллера основана на том, что при наличии белка в моче на границе азотной кислоты и мочи происходит его коагуляция и появляется белое кольцо. В пробирку наливают 1—2 мл 30 % раствора азотной кислоты и осторожно по стенке пробирки наслаивают точно такое же количество профильтрованной мочи. Появление белого кольца на границе двух жидкостей указывает на наличие белка в моче. Следует помнить, что иногда белое кольцо образуется при наличии большого количества уратов, но в отличие от белкового кольца оно появляется несколько выше границы между двумя жидкостями и растворяется при нагревании [Плетнева Н.Г., 1987]. Из количественных методов наиболее часто применяются: 1) унифицированный метод Брандберга—Робертса—Стольникова, в основу которого положена кольцевая проба Геллера;
2) фотоэлектроколориметрический метод количественного определения белка в моче по помутнению, образующемуся при добавлении сульфасалициловой кислоты;
3) биуретовый метод. Выявление белка в моче упрощенным ускоренным методом проводят колориметрическим методом с помощью индикаторной бумаги, которую выпускают фирмы «Lachema» (Словакия), «Albuphan», «Ames» (Англия), «Albustix», «Boehringer» (Германия), «Comburtest» и др. Метод заключается в погружении в мочу специальной бумажной полоски, пропитанной тетрабромфеноловым синим и цитратным буфером, которая меняет свой цвет от желтого до синего в зависимости от содержания белка в моче. Ориентировочно концентрацию белка в исследуемой моче определяют с помощью стандартной шкалы. Для получения правильных результатов необходимо соблюдать следующие условия. рН мочи должна быть в пределах 3,0—3,5; при слишком щелочной моче (рН 6,5) будет получен ложноположительный результат, а при слишком кислой моче (рН 3,0) — ложноотрицательный. Бумага должна находиться в контакте с исследуемой мочой не дольше, чем указано в инструкции, в противном случае тест даст ложноположительную реакцию. Последнюю также наблюдают и при содержании в моче большого количества слизи. Чувствительность различных видов и серий бумаги может быть различной, поэтому к количественной оценке белка в моче этим методом следует относиться осторожно. Определение его количества в суточной моче при помощи индикаторной бумаги невозможно [Плетнева Н.Г., 1987] Существует несколько способов определения количества белка, выделившегося с мочой за сутки. Наиболее простым является метод Брандберга —Робертса—Стольникова. Методика. 5-10 мл тщательно перемешанной суточной мочи наливают в пробирку и осторожно по стенкам ее добавляют 30 % раствор азотной кислоты. При наличии белка в моче в количестве 0,033 % (т.е. 33 мг на 1 л мочи) через 2-3 мин появляется тонкое, но четко видимое белое кольцо. При меньшей его концентрации проба отрицательная. При большем содержании белка в моче его количество определяют путем многократных разведений мочи дистиллированной водой до тех пор, пока не перестанет образовываться кольцо. В последней пробирке, в которой еще видно кольцо, концентрация белка будет составлять 0,033 %. Умножив 0,033 на степень разведения мочи, определяют содержание белка в 1 л неразведенной мочи в граммах. Затем рассчитывают содержание белка в суточной моче по формуле: где К — количество белка в суточной моче (г); х — количество белка в 1 л мочи (г); V — количество мочи, выделенное за сутки (мл). В норме в течение суток с мочой выделяется от 27 до 150 мг (в среднем 40—80 мг) белка. Указанная проба позволяет определить в моче только мелкодисперсные белки (альбумины). Более точные количественные методы (колориметрический метод Кьельдаля и др.) довольно сложны и требуют специальной аппаратуры. При почечной протеинурии с мочой выделяются не только альбумины, но и другие виды белка. Нормальная протеинограмма (по Зейцу и соавт., 1953) имеет следующее процентное содержание: альбуминов — 20 %, α1-глобулинов — 12 %, α2-глобулинов — 17 %, γ-глобулинов — 43 % и β-глобулинов — 8 %. Отношение альбуминов к глобулинам изменяется при различных заболеваниях почек, т.е. нарушается количественное соотношение между белковыми фракциями. Наиболее распространенными методами фракционирования уропротеинов являются следующие: высаливание нейтральными солями, электрофоретическое фракционирование, иммунологические методы (реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофоретический анализ, преципитационный иммуноэлектрофорез), хроматография, гель-фильтрация, а также ультрацентрифугирование. В связи с внедрением методов фракционирования уропротеинов, основанных на изучении электрофоретической подвижности, вариабильности молекулярной массы, размеров и формы молекул уропротеинов, появилась возможность выделять характерные для того или иного заболевания типы протеинурии, изучать клиренсы индивидуальных плазменных белков. К настоящему времени в моче идентифицировано свыше 40 плазменных белков, В том числе в нормальной моче 31 плазменный белок [Berggard, 1970]. В последние годы появилось понятие селективности протеинурии. В 1955 г. Hardwicke и Squire сформулировали понятие «селективная» и «неселективная» протеинурия, определив, что фильтрация плазменных белков в мочу подчиняется определенной закономерности: чем больше молекулярная масса белка, экскретируемого в мочу, тем меньше его клиренс и тем ниже концентрация его в окончательной моче. Протеинурия, соответствующая этой закономерности, является селективной в отличие от неселективной, для которой характерным является извращение выведенной закономерности. Обнаружение в моче белков с относительно большой молекулярной массой свидетельствует об отсутствии избирательности почечного фильтра и выраженном его поражении. В этих случаях говорят о низкой селективности протеинурии. Поэтому в настоящее время широкое распространение получило определение белковых фракций мочи с использованием методов электрофореза в крахмальном и полиакриламидном геле. По результатам этих методов исследования можно судить о селективности протеинурии. По данным В.С.Махлиной (1975), наиболее оправданным является определение селективности протеинурии путем сравнения клиренсов 6—7 индивидуальных белков плазмы крови (альбумина, транеферрина, α2 — макроглобулина, IgA, IgG, IgM) с использованием точных и специфичных количественных иммунологических методов реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини, иммуноэлектрофоретического анализа и преципитального иммуноэлектрофореза. Степень селективности протеинурии определяют по индексу селективности, представляющего собой отношение сравниваемого и эталонного белков (альбумина). Изучение клиренсов индивидуальных плазменных белков позволяет получить достоверные сведения о состоянии фильтрационных базальных мембран клубочков почки. Связь между характером экскретируемых в мочу белков и изменениями базальных мембран клубочков настолько выражена и постоянна, что по уропротеинограмме можно косвенно судить о патофизиологических изменениях в клубочках почек. В норме средний размер пор гломерулярной базальной мембраны составляет 2,9—4 А° НМ, которые могут пропускать белки, имеющие молекулярную массу до 10 4 (миоглобулин, кислый α1 — гликопротеин, легкие цепи иммуноглобулинов, Fc и Fab — фрагменты IgG, альбумин и трансферрин). При гломерулонефрите, нефротическом синдроме размеры пор в базальных мембранах клубочков увеличиваются, в связи с чем базальная мембрана становится проницаемой для белковых молекул большого размера и массы (церулоплазмин, гаптоглобин, IgG, IgA и др.). При крайней степени повреждения клубочков почек в моче появляются гигантские молекулы белков плазмы крови (α2-макроглобулин, IgM и β2-липопротеин). Определяя белковый спектр мочи, можно сделать заключение о преимущественном поражении тех или иных участков нефрона. Для гломерулонефрита с преимущественным поражением гломерулярных базальных мембран характерно наличие в моче крупно- и среднемолекулярных белков. Для пиелонефрита с преимущественным поражением базальных мембран канальцев характерны отсутствие крупномолекулярных и наличие повышенных количеств средне- и низкомолекулярных белков. Концентрацию этого белка в плазме крови и моче определяют радиоиммунологическим методом с помощью стандартного набора «Phade-bas β2-mikroiest» (фирма «Pharmaсia», Швеция). В сыворотке крови здоровых людей содержится в среднем 1,7 мг/л (колебания от 0,6 до 3 мг/л), в моче — в среднем 81 мкг/л (максимально 250 мкг/л) β2-микроглобулина. Превышение его в моче свыше 1000 мкг/л — явление патологическое. Содержание β2-микроглобулина в крови увеличивается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением клубочковой фильтрации, в частности при остром и хроническом гломерулонефрите, поликистозе почек, нефросклерозе, диабетической нефропатии, острой почечной недостаточности. Концентрация β2-микроглобулина в моче повышается при заболеваниях, сопровождающихся нарушением реабсорбционной функции канальцев, что приводит к увеличению экскреции его с мочой в 10—50 раз, в частности, при пиелонефрите, ХПН, гнойной интоксикации и др. Характерно, что при цистите в отличие от пиелонефрита не наблюдается увеличения концентрации β2-микроглобулина в моче, что может быть использовано для дифференциальной диагностики этих заболеваний. Однако при интерпретации результатов исследования надо учитывать, что любое повышение температуры всегда сопровождается увеличением экскреции β2-микроглобулина с мочой. Средние молекулы (СМ), иначе называемые белковыми токсинами, представляют собой вещества с молекулярной массой 500—5000 дальтон. Физическая структура их неизвестна. В состав СМ входят по меньшей мере 30 пептидов: окситоцин, вазопрессин, ангиотензин, глюкагон, адренокортикотропный гормон (АКТГ) и др. Избыточное накопление СМ наблюдается при снижении функции почек и содержании в крови большого количества деформированных белков и их метаболитов. Они обладают разнообразным биологическим действием и нейротоксичны, вызывают вторичную иммунодепрессию, вторичную анемию, угнетают биосинтез белка и эритропоэз, тормозят активность многих ферментов, нарушают течение фаз воспалительного процесса. Уровень СМ в крови и моче определяют скрининговым тестом, а также путем спектрофотометрии в ультрафиолетовой зоне по длине волны 254 и 280 мм на спектрофотометре ДИ-8Б, а также динамической спектрофотометрии с компьютерной обработкой в диапазоне волн 220—335 нм на том же спектрометре фирмы Beckman. За норму принимают содержание СМ в крови, равное 0,24 ± 0,02 усл. ед., а в моче — 0,312 ± 0,09 усл. ед.
Будучи нормальными продуктами жизнедеятельности организма, они удаляются из него в норме ночками путем гломерулярной фильтрации на 0,5 %; 5 % их утилизируется другим путем. Все фракции СМ подвергаются канальцевой реабсорбции. Кроме белков плазмы крови, в моче могут быть неплазменные (тканевые) протеины. По данным Buxbaum и Franklin (1970), неплазменные белки составляют приблизительно 2/3 всех биоколлоидов мочи и значительную часть уропротеинов при патологической протеинурии. Тканевые белки попадают в мочу непосредственно из почек или органов, анатомически связанных с мочевыми путями, или попадают из других органов и тканей в кровь, а из нее через базальные мембраны клубочков почки — в мочу. В последнем случае экскреция в мочу тканевых протеинов происходит аналогично выведению плазменных белков различной молекулярной массы. Состав неплазменных уропротеинов чрезвычайно разнообразен. Среди них гликопротеины, гормоны, антигены, ферменты (энзимы). Тканевые протеины в моче выявляют с помощью обычных методов белковой химии (ультрацентрифугирование, гель-хроматография, различные варианты электрофореза), специфических реакций на ферменты и гормоны и иммунологических методов. Последние позволяют также определить концентрацию неплазменного уропротеина в моче и в ряде случаев определить тканевые структуры, ставшие источником его появления. Основным методом выявления в моче неплазменного белка является иммунодиффузионный анализ с антисывороткой, полученной иммунизацией экспериментальных животных мочой человека и истощенной (адсорбированной) в последующем белками плазмы крови. При патологическом процессе наблюдаются глубокие нарушения жизнедеятельности клеток, сопровождающиеся выходом внутриклеточных ферментов в жидкостные среды организма. Энзимодиагностика базируется на определении ряда ферментов, выделившихся из клеток пораженных органов и не свойственных сыворотке крови.
Исследования нефрона человека и животных показали, что в отдельных его частях имеется высокая ферментативная дифференциация, тесно связанная с функциями, которые выполняет каждый отдел. В клубочках почки содержится относительно небольшое количество различных энзимов. Клетки почечных канальцев, особенно проксимальных отделов, содержат максимальное количество энзимов. Высокая их активность наблюдается в петле Генле, прямых канальцах и собирательных трубочках. Изменения активности отдельных энзимов при различных заболеваниях почек зависят от характера, остроты и локализации процесса. Они наблюдаются до появления морфологических изменений в почках. Поскольку содержание различных ферментов четко локализовано в нефроне, определение того или иного фермента в моче может способствовать топической диагностике патологического процесса в почках (клубочки, канальцы, корковый или мозговой слой), дифференциальной диагностике почечных заболеваний и определению динамики (затухание и обострение) процесса в почечной паренхиме. Дли дифференциальной диагностики заболеваний органов мочеполовой системы применяют определение активности в крови и моче следующих ферментов: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), лейцинаминопептидазы (ЛАП), кислой фосфатазы (КФ), щелочной фосфатазы (ЩФ), β-глюкуронидазы, глютамино-щавелевоуксусной трансаминазы (ГЩТ), альдолазы, трансамидиназы и др. Активность ферментов в сыворотке крови и в моче определяют с помощью биохимических, спектрофотометрических, хроматографических, флуориметрических и хемилюминесцентных методов. Энзимурия при заболеваниях почек более выражена и закономерна, чем энзимемия. Она особенно сильно выражена в острой стадии заболевания (острый пиелонефрит, травма, распад опухоли, инфаркт почки и т.д.). При этих заболеваниях обнаруживается высокая активность трансамидиназы, ЛДГ, ЩФ и КФ, гиалуронидазы, ЛАП, а также таких неспецифических энзимов, как ГЩТ, каталаза [Полянцева Л.Р., 1972]. Селективная локализация ферментов в нефроне при обнаружении ЛАП и ЩФ в моче позволяет с уверенностью говорить об острых и хронических заболеваниях почек (острая почечная недостаточность, некроз почечных канальцев, хронический гломерулонефрит) [Шеметов В.Д., 1968]. По данным А.А.Карелина и Л.Р.Полянцевой (1965), трансамидиназа содержится лишь в двух органах — почке и поджелудочной железе. Она является митохондриальным ферментом почек и в норме в крови и моче отсутствует. При различных заболеваниях почек трансамидиназа появляется в крови и в моче, а при поражении поджелудочной железы — только в крови. Дифференциальным тестом в диагностике гломерулонефрита и пиелонефрита Krotkiewski (1963) считает активность ЩФ в моче, повышение которой более характерно для пиелонефрита и диабетического гломерулосклероза, чем для острого и хронического нефрита. Нарастающая в динамике амилаземия при одновременном снижении амилазурии может указывать на нефросклероз и сморщивание почки, ЛАП имеет наибольшее значение при патологических изменениях в клубочках и извитых канальцах почки, поскольку содержание ее в этих отделах нефрона более высокое [Шепотиновский В.П. и др., 1980]. Для диагностики волчаночного нефрита рекомендуется определение β-глюкуронидазы и КФ [Приваленко М.Н. и др., 1974]. При оценке роли энзимурии в диагностике заболеваний почек следует учитывать следующие положения. Энзимы, будучи по своей природе белками, при малой молекулярной массе могут проходить через неповрежденные клубочки, определяя так называемую физиологическую энзимурию. Среди этих энзимов постоянно определяются в моче α-амилаза (относительная молекулярная масса 45 ООО) и уропепсин (относительная молекулярная масса 38000). Наряду с низкомолекулярными энзимами в моче здоровых лиц могут быть обнаружены в небольшой концентрации и другие энзимы: ЛДГ, аспартат- и аланинаминотрансферазы, ЩФ и КФ, мальтаза, альдолаза, липаза, различные протеазы и пептидазы, сульфатаза, каталаза, рибонуклеаза, пероксидаза [King, Воусе, 1963]. Высокомолекулярные энзимы с относительной молекулярной массой больше 70000-100000, по мнению Richterich (1958) и Hess (1962), могут проникать в мочу лишь при нарушении проницаемости клубочкового фильтра. Нормальное содержание ферментов в моче не позволяет исключить патологический процесс в почке при окклюзии мочеточника. При эпзимурии возможен выход энзимов не только из самих почек, но и из других паренхиматозных органов, клеток слизистых оболочек мочевых путей, предстательной железы, а также форменных элементов мочи при гематурии или лейкоцитурии. Большинство энзимов неспецифично по отношению к почке, поэтому откуда происходят энзимы, обнаруженные в моче здоровых и больных, установить трудно. Однако степень энзимурии даже дли неспецифичных энзимов при поражении почек бывает выше нормы или той, которая наблюдается при заболеваниях других органов. Более ценную информацию может дать комплексное исследование в динамике ряда ферментов, особенно органоспецифичных, таких как трансаминаза. В решении вопроса о почечном происхождении энзима в моче помогает исследование изоэнзимов с выявлением фракций, типичных для изучаемого органа. Изоэнзимы — это энзимы, изогенные по действию (катализируют одну и ту же реакцию), но гетерогенные по химической структуре и другим свойствам. Каждая ткань имеет характерный для нее изоэнзимный спектр. Ценными методами разделения изоэнзимов являются электрофорез в крахмальном и полиакриламидном геле, а также ионообменная хроматография. При миеломной болезни и макроглобулинемии Вальденстрема в моче обнаруживают белок Бенс-Джонса. Метод обнаружения названного белка в моче основан на реакции термопреципитации. Применявшиеся ранее методы, с помощью которых оценивают растворение этого белка при температуре 100 °С и повторное осаждение при последующем охлаждении, ненадежны, так как не все белковые тела Бенс-Джонса обладают соответствующими свойствами. Более достоверно выявление этого парапротеина путем осаждения его при температуре 40 -60 °С. Однако и в этих условиях осаждения может не произойти в слишком кислой (рН 6,5) моче, при низкой ОПМ и низкой концентрации белка Бенс-Джонса. Наиболее благоприятные условия для его осаждения обеспечивает методика, предложенная Patnem: 4 мл профильтрованной мочи смешивают с 1 мл 2 М ацетатного буфера рН 4,9 и согревают 15 мин на водяной бане при температуре 56 °С. При наличии белка Бенс-Джонса в течение первых 2 мин появляется выраженный осадок. При концентрации белка Бенс-Джонса меньше 3 г/л проба может быть отрицательной, но на практике это встречается крайне редко, поскольку его концентрация в моче, как правило, более значительна. На пробы с кипячением нельзя вполне полагаться. С полной достоверностью он может быть обнаружен в моче иммуно-электрофоретическим методом с использованием специфических сывороток против тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов. источник Понравилась статья? Поделись с друзьями! 95 |